奚琦++許志茹++王琪++曲春浦++楊成君++劉關君

摘要：銅（Cu）是植物生長發(fā)育所必需的微量元素，參與光合作用、呼吸作用及木質素合成等多個生物學過程。銅離子具有氧化還原特性，低銅或者過量銅都會對植物造成傷害，因此植物在長期進化過程中產(chǎn)生了一套完整的銅穩(wěn)態(tài)調控體系，其中miRNA在此體系中扮演著重要的角色。介紹了miR397、miR398、miR408、miR857、miR1444等5種 Cu-miRNAs，它們的靶基因編碼了植物細胞中非常重要的4大類含銅蛋白——漆酶、超氧化物歧化酶、質體藍素和多酚氧化酶。在銅脅迫條件下，miRNA通過調控靶基因的表達優(yōu)化銅離子的分配，既保證了銅的正常供應，又避免了銅毒害。

關鍵詞：銅穩(wěn)態(tài)；Cu-miRNAs；銅脅迫；研究進展

中圖分類號： Q754文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）09-0005-05

銅（Cu）廣泛存在于動物、植物和微生物體內，是正常生命活動所必需的微量礦質元素。銅在植物的生長發(fā)育過程中行使重要功能，植物中含有100多種不同的含銅蛋白，參與各種新陳代謝過程，如光合作用、呼吸作用電子傳遞鏈、活性氧代謝、對乙烯的感受、氮代謝、細胞壁的木質化及花粉的形成等[1]。在這些過程中，銅作為輔因子與細胞內Cu/Zn超氧化物歧化酶（Cu/Zn SOD）、細胞色素氧化酶、多酚氧化酶、抗壞血酸氧化酶、多胺氧化酶等多種酶結合后行使生物學功能。

缺銅條件會導致植物葉片失綠，葉尖卷曲變白，植株矮小，生長緩慢，產(chǎn)量下降。植物細胞中銅濃度過高會使植株生長發(fā)育不良，根部畸形，根細胞質膜損傷，質膜過氧化作用增強，氮素吸收及氨基酸合成受阻；銅濃度過高，還可使植物葉片黃化，葉綠素a/b比降低，光合系統(tǒng)Ⅰ、Ⅱ的電子傳遞能力降低，光合作用速率下降；此外，銅濃度過高還會使細胞核中DNA與蛋白質的結構被破壞、DNA復制和轉錄受影響，使含銅蛋白的合成、基因表達調控發(fā)生紊亂[2-4]。

植物在光合電子傳遞鏈、呼吸鏈中產(chǎn)生的活性氧（ROS）在生成部位就會被及時分解；而當植物吸收過量銅后，植物細胞會快速積累超氧化物陰離子（ O-2· ）、羥自由基（·OH）、過氧化氫（H2O2）和單線態(tài)氧（1O2）等活性氧，并進一步毒害植物細胞[5]。此外，自然界中的植物在不同土壤環(huán)境條件下可能會面臨重金屬脅迫，但植物銅中毒的情況并不常見，由此認為，植物通過在進化過程中形成完善的銅穩(wěn)態(tài)調控體系應對上述脅迫條件，以維持正常的生長發(fā)育過程。一般認為，環(huán)境中的銅離子通過CTR銅轉運家族成員高效轉運到植物細胞內，之后，銅伴侶蛋白將銅離子運送至需銅蛋白。銅伴侶蛋白ATX1、CCH向銅轉運P型ATP酶HMA5、RAN1或Ccc2運送銅離子，之后銅離子進入分泌途徑或者運送到細胞外；COX銅伴侶蛋白將銅離子運送到線粒體中的細胞色素C氧化酶，參與呼吸鏈中的電子傳遞；P型ATP酶PAA1、PAA2將銅離子運送到質體藍素參與植物光合作用；銅伴侶蛋白CCS將銅離子運送給銅鋅超氧化物歧化酶，參與細胞對氧自由基的清除[6]。在這些過程中，miRNA對銅穩(wěn)態(tài)的調節(jié)至關重要。

1miRNA簡介

1.1miRNA的發(fā)現(xiàn)

miRNA是一類目前被廣泛研究的內源性單鏈非編碼小分子RNA，長度約為16～29 nt，大部分長度為21～23 nt[7]。1993年首次在秀麗新小桿線蟲中發(fā)現(xiàn)了可時序調控胚胎后期發(fā)育的miRNA lin-4[8]。2000年，Reinhart等在線蟲中發(fā)現(xiàn)了第2個異時性開關基因let27，并在人類細胞中找到了該基因的同源基因[9]。2001年，小RNA被統(tǒng)一命名為microRNA（miRNA）。2002年，4個科學小組從植物中分別發(fā)現(xiàn)了miRNA，自此拉開了植物miRNA研究的序幕[10-13]。盡管植物miRNA的研究起步較晚，但是隨著研究方法的不斷革新，越來越多的植物miRNA逐步被鑒定（數(shù)據(jù)庫網(wǎng)址：http：//microrna.sanger.ac.uk）。隨著高通量測序技術的發(fā)展與應用，相信未來幾年內該數(shù)據(jù)庫中植物miRNA的信息還會被快速豐富。

1.2miRNA的生物合成

編碼miRNA的基因在RNA聚合酶Ⅱ的作用下形成初級轉錄物 pri-miRNA[14]，長度大約為300～1 000核苷酸。pri-miRNA在一種類Dicer酶——DCL1的作用下被剪切成包含莖環(huán)結構的60～300 nt的miRNA前體pre-miRNA[15]。然后，pre-miRNA被DCL1切割產(chǎn)生約21～26 nt的雙鏈miRNA，構成miRNA/miRNA*雙鏈分子[16]。在miRNA甲基轉移酶HEN1的作用下，miRNA/miRNA*雙鏈分子3′端最后1個核苷酸發(fā)生甲基化修飾，形成成熟的miRNA[17]。之后，成熟的miRNAs被HASTY（homogentisate solanesyl transferase，簡稱HST）轉運至細胞核外[18]。成熟的miRNAs序列會自身折疊成不完全配對的發(fā)卡結構進入RNA介導的沉默復合體RNA誘導沉默復合體（RNA-induced silencing complex，簡稱RISC）中行使進一步的功能[19]。miRNA本身并不具備核酸酶的功能，在RISC中它僅發(fā)揮靶向作用，與miRNA形成RISC的AGO蛋白對靶基因具有切割能力[20-21]。

1.3植物miRNA對靶基因的調控

miRNA可以通過堿基互補配對的方式實現(xiàn)對靶基因mRNA的切割或者抑制mRNA翻譯，進而參與調控植物的生長發(fā)育。miRNA抑制mRNA的翻譯亦或是切割mRNA取決于miRNA與靶序列互補配對的程度?；パa配對程度高則可能對mRNA進行切割，而配對程度低則只是抑制mRNA的翻譯[22]。在植物中，miRNA和靶基因的互補程度高于動物，大部分植物miRNA和靶基因只存在4個以下的核苷酸錯配。

相比于動物中有60%的蛋白質受miRNA的調控，植物中只有不到10%的蛋白質是受miRNA調控的。盡管如此，植物中的miRNA在生長發(fā)育、激素響應、抗逆抗病等多個方面仍然發(fā)揮著至關重要的調控作用。

2銅穩(wěn)態(tài)中的miRNAs

在銅脅迫響應過程中，植物體內多個miRNA通過調節(jié)不同功能的含銅蛋白以維持內部環(huán)境的穩(wěn)定。有研究表明，miR395、miR397、miR398、miR408、miR857及miR1444均參與了植物的低銅響應。Burkhead等將miR397、miR408、miR398和miR857這4種非常保守的miRNA統(tǒng)稱為Cu-miRNAs[23]。Cu-miRNAs參與了光合作用、呼吸作用、抗氧化及木質素合成等過程。近期的研究表明，miR1444在楊樹的銅應答過程中也發(fā)揮重要功能。

大量研究顯示，Cu-miRNAs在植物營養(yǎng)穩(wěn)態(tài)中扮演重要角色，即Cu-miRNAs除了受銅調控之外，還受多種元素的調控。miR397受碳（C）、氮（N）、硫（S）、磷（P）、鎘（Cd）、鐵（Fe）元素調控；miR398受C、N、S、P、Cd、Fe、鋅（Zn）元素調控；miR408受P、N、Fe元素調控；miR857受P、N元素調控；同時，miR857在擬南芥中也是鎘應答miRNA，植株缺乏C、N、S、P元素時，miR857的表達受抑制[24-27]。

此外，Cu-miRNAs在植物發(fā)育、新陳代謝和防御過程中均發(fā)揮重要功能。各種脅迫處理也可以影響Cu-miRNAs表達，如寒冷、NaCl、強光、病原菌、干旱、臭氧及氧化等非生物、生物脅迫會誘導或抑制Cu-miRNAs表達，且同一種Cu-miRNA在不同植物中具有不同的應答模式。因此，研究Cu-miRNAs生物學功能時，不能忽視大量脅迫處理對其表達的影響，甚至有人推測，這些脅迫對Cu-miRNAs的調控是影響植物生長受阻的唯一因素[27]。

2.1miR397

miR397的靶基因是以銅為輔基的漆酶（LAC）的編碼基因。1985年，Bertrand首次在漆樹中鑒定了漆酶。漆酶是一種多銅氧化酶，1分子蛋白結合4個銅離子。植物漆酶分泌到細胞壁后，在有氧條件下可以催化木質素單體聚合成木質素。Liang等測定擬南芥lac15突變體種子木質素含量時發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，突變體木質素總含量約降低了30%，第1次直接證明了漆酶參與植物木質素的合成過程[28]。Berthet等研究表明，擬南芥lac4-1lac17、lac4-2lac17雙突變體的木質素含量均比野生型降低了20%～40%；而lac4、lac17單突變體中木質素含量變化不明顯，首次證明了LAC4、LAC17參與了擬南芥莖的木質化過程[29]。

擬南芥miR397家族有2個成員，通過與LAC2、LAC4、LAC17的第5個外顯子結合而降解這些靶基因[30]。在擬南芥中過表達miR397b，LAC2、LAC3、LAC9、LAC10、LAC12、LAC14、LAC15、LAC16、LAC17等基因的表達水平均降低，轉基因植株木質素積累量明顯降低，次級細胞壁厚度降低，花序數(shù)量增加，種子增大，種子數(shù)量增加。突變LAC4基因的miR397作用位點（但不改變基因編碼的氨基酸序列）后，與野生型擬南芥相比，轉基因植株變矮，蓮座葉變小，果莢變少變短，種子數(shù)量減少[31]。在水稻中過表達OsmiR397，轉基因植株也出現(xiàn)了種子變大、花序增加的現(xiàn)象，且單位面積產(chǎn)量增加了25%[32]。

毛果楊miR397含有3個家族成員miR397a、miR397b、miR397c，生物信息學預測結果顯示，至少有26個漆酶基因可以作為miR397a的靶基因[33]。Lu等研究了毛果楊miR397的靶基因——3種漆酶基因PtLAC5、PtLAC6、PtLAC110a，發(fā)現(xiàn)在銅處理下，PtLAC5、PtLAC6在所檢測的組織中均表達，PtLAC5在幼莖中表達量最高，PtLAC6在發(fā)育中的次生木質部中表達量最高，PtLAC110a是一種根特異性表達的漆酶基因；此外，毛果楊根莖葉中miR397a的含量隨著銅濃度的增加而降低，其靶基因PtLAC5、PtLAC6、PtLAC110a的表達量則隨著銅處理濃度的增加而增加[34]。

2.2miRNA398

銅穩(wěn)態(tài)過程中，miR398的靶基因有3種，分別編碼含銅蛋白Cu/Zn超氧化物歧化酶、線粒體細胞色素C氧化酶亞基V（COX5b.1）、超氧化物歧化酶的銅伴侶蛋白（CCS1）[35]。相關研究表明，miR398與編碼銅/鋅超氧化物歧化酶的2個基因CSD1、CSD2及編碼線粒體細胞色素C氧化酶亞基Ⅴ的COX5b.1 mRNA上的核苷酸序列互補性在擬南芥、水稻中是保守的[36]。miR398與CSD2 mRNA的編碼區(qū)互補，與CSD1、COX5b.1 mRNA的5′非編碼區(qū)（5′-UTR）互補[37]。miR398家族具有2個成員（3個基因座），其中miR398b與miR398c的核苷酸序列完全相同，miR398a 3′端的最后1個核苷酸與miR398b、miR398c存在差異[38]。

銅離子過量條件下ROS會過量積累。Cu/Zn SOD可以專一性地清除細胞內的ROS，將其降解為分子氧、過氧化氫。當水稻體內產(chǎn)生大量ROS時，miR398的表達水平降低，導致細胞質CSD1、葉綠體CSD2的表達量快速上調，使細胞內的銅離子流向Cu/Zn SOD，Cu/Zn SOD的活性增強，既降低了細胞內自由銅離子的含量，又使細胞具有更強的清除氧自由基的能力，進而使植物表現(xiàn)出抗氧化能力[39]。在擬南芥中過表達miR398前體的共抑制轉基因植株中，miR398b、miR398c的表達量降低，導致靶基因CSD的表達量增加，相對于野生型植株，在高銅處理狀態(tài)下轉基因幼苗發(fā)芽率明顯提高，在強氧化劑甲基紫精處理后轉基因幼苗的生長發(fā)育未受影響[38]。

在水稻中，根據(jù)密碼子的簡并性，突變CSD2基因上miR398的結合位點，但不改變CDS2的氨基酸序列，相關研究表明，CSD2基因的表達不再受miR398調控，重金屬銅處理后轉基因植株的抗性明顯增加[40]。過表達miR398b、miR398c的擬南芥植株出現(xiàn)了CSD1、CSD2水平降低的現(xiàn)象，但COX5b.1的mRNA、蛋白質含量均未受到影響；與miR398互補的CSD1、CSD2基因的核苷酸序列突變后，miR398不能識別CSDs基因，CSD1、CSD2的mRNA水平上調，但是CSD1、CSD2蛋白水平卻依然對miR398敏感，這暗示miRNA在不能與靶mRNA完全互補的時候，可以負調控靶蛋白的翻譯過程[37]。

2.3miRNA408

miR408在植物體內的主要功能是參與非生物脅迫應答和維持細胞內銅離子含量的穩(wěn)定性，目前對miR408的研究還比較少。miR408的靶基因編碼了光合電子傳遞鏈中的含銅蛋白質體藍素（PC）、參與木質素氧化聚合的漆酶[41]。PC是植物光合電子傳遞鏈中位于類囊體膜內表面的銅蛋白[42]，是光系統(tǒng)Ⅰ電子傳遞鏈的重要組成部分，1分子PC含有1個銅離子。植物中大約有50%銅離子結合PC存在于葉綠體中，從而參與光合作用。

Sunkar認為，擬南芥miR408的目標基因是質體藍素基因PC和3種漆酶基因LAC3、LAC12、LAC13[43]。預測表明，miR408通過與LAC3、LAC12、LAC13的5′-UTR結合而調控靶基因的表達[30]。在毛果楊中，miR408的靶基因包括質體藍素蛋白家族基因（PCLs）PtPCL1、PtPCL2、PtPCL3及漆酶基因PtLAC4。毛果楊miR408在成熟葉、次生木質部及韌皮部中表達量較高，且表達量隨著銅濃度的升高而降低，其靶基因的表達水平則隨著銅濃度的升高而增加[34]。擬南芥、毛果楊、水稻miR408的核苷酸序列比對結果表明，miR408是一種高度保守的miRNA，在大量單子葉、雙子葉甚至裸子植物中都存在[44]。

在擬南芥中，當銅離子匱乏時，轉錄因子SPL7會與miR408啟動子區(qū)的多個GTAC基序結合，誘導miR408表達；在spl7突變體中過表達miR408，低銅條件下轉化子的光合速率、質體藍素功能恢復正常[45]。此外，研究者推測，轉基因植物如果能降低miR408表達量，引起漆酶含量升高，即可達到通過增加維管組織中木質素含量而增強植物抵抗病原菌侵染能力的目的。

2.4miR857

目前，對miR857的研究還較少。miR857的靶基因是漆酶家族中的LAC7，通過與LAC7的第1個外顯子結合控制LAC7的表達[30]。LAC7在擬南芥葉片的排水器、根毛中特異表達[46]；miR857還在擬南芥維管組織的次生生長中發(fā)揮作用[47]。此外，在擬南芥果實中miR857不表達，過表達miR857的擬南芥轉基因植株出現(xiàn)了異常的小角果，使種子嚴重減產(chǎn)；盡管在轉基因植株中并沒有找到miR857和角果大小的相關性，但是擬南芥LAC7的表達量與種子數(shù)量具有明顯的相關性，LAC7的表達量不足，會嚴重影響種子的生成[48]。在很長一段時間內，研究者認為，miR857只在擬南芥中存在。隨著測序技術的不斷發(fā)展，在其他植物中陸續(xù)鑒定了miR857。有研究表明，miR857在十字花科植物中是保守的[49]。在白色羽扇豆中，miR857在根、莖、葉中均表達，缺磷處理后其表達量降低[50]。Zhang等于2014年在棉花中也鑒定了miR857[51]。

2.5miR1444

毛果楊中的miR1444是一種楊樹特異性miRNA。在楊樹中，miR1444調控銅蛋白多酚氧化酶（PPO）[34]，PPO具有將酚類氧化成醌類的功能[52]。Lu等研究表明，PtPPO3、PtPPO6是miRNA1444的靶基因，并預測楊樹中至少有13個PtPPOs基因受miR1444調控；隨著銅處理濃度的增加，miR1444的表達量降低，而其靶基因PtPPO3、PtPPO6的表達量逐漸增加[34]。當銅缺乏時，miR1444積累，PPO的表達被抑制[53]。此外，銅缺乏條件下，毛果楊中鋅離子含量明顯上升；隨著鋅離子濃度的增加，各組織中miR1444含量均呈上升趨勢，且miR1444的靶基因表達量下降。這些研究表明，miR1444不僅受銅調控，還參與了鋅脅迫的應答[54]。

綜上所述，隨著外界銅濃度的變化，植物通過特定Cu-miRNAs的表達調節(jié)含銅蛋白的含量，進而維持植物細胞內的銅穩(wěn)態(tài)。表1中列舉了植物中的Cu-miRNAs及其靶基因[27，44]。

3SPL7轉錄因子對miRNA的調控

所有低銅響應相關的miRNA和基因，在其啟動子上均含有GTAC基序。GTAC基序最初是在綠藻的糞生素氧化酶（Cpx1）和細胞色素C6（Cyc6）基因的啟動子區(qū)域鑒定的，GTAC基序被稱為銅響應元件（CuRE）[55]。GTAC基序是轉錄因子SPL7的結合位點，SPL7與這一銅響應特定基序的結合決定了植物miRNA對銅脅迫的應答[56]。

GTAC基序是Cu-miRNAs和某些基因受低銅調控所必需的。當銅獲取受限時，SPL7會上調細胞的銅攝取量和吸收量，即SPL7通過上調細胞膜上的COPT1銅轉運蛋白的表達量來行使此功能[53]。銅缺乏條件會誘導植物中miR398、miR397、miR408和miR857的上調表達，miRNAs進而下調含銅蛋白CCS、Cu/Zn SOD、PCL、LAC和PPO的表達量。例如，銅匱乏條件下，毛果楊中一些銅相關miRNA會下調一些含銅蛋白基因的轉錄，降低含銅蛋白的含量，從而將銅優(yōu)先供給COX和PC等光合電子傳遞鏈中重要的含銅蛋白[23]。在恢復銅供給后，質體藍素水平和光合電子傳遞效率先于其他含銅蛋白被優(yōu)先恢復，銅相關的miRNAs能調節(jié)輔因子銅的優(yōu)先供給順序[53]。在spl7突變體中，miR397a、miR408和miR857的表達不再受低銅條件誘導，這說明SPL7在調節(jié)植物體內銅分配過程中發(fā)揮重要作用（圖1）[56]。

4展望

自線蟲中發(fā)現(xiàn)的第1個miRNA至今，已有30 000多個miRNAs被鑒定，據(jù)估計miRNA基因約占基因總量的1%，因此，仍有大量的miRNA尚未被鑒定。目前，Cu-miRNAs的研究仍集中于miR397、miR398、miR408、miR857和miR1444等miRNAs中。隨著高通量測序技術的不斷進步，期望能在更多的物種中發(fā)現(xiàn)新的Cu-miRNAs。

盡管很多miRNAs被證實與植物的生長發(fā)育和逆境脅迫抗性相關，但是某些miRNAs對靶基因的調控機制尚不清晰。miRNA一般靶向1個基因家族或者作用于相同代謝途徑中的基因，這種一對多的形式為研究miRNA調控網(wǎng)絡增加了難度。目前對植物miRNA的相關研究多集中在確定miRNA與脅迫抗性的相關性方面。

植物殺菌劑的施加、銅礦的長期開采、生活污水的排放等提高了土壤中的銅離子濃度[57]。在發(fā)現(xiàn)Cu-miRNAs之前，銅轉運蛋白及銅伴侶蛋白是植物抗銅分子生物學研究的重點；miRNA的表達比蛋白質更迅速，效率更高，可以快速應對外界銅離子濃度的變化情況。因此，通過轉基因手段調控 Cu-miRNAs 表達，培育更具耐受銅脅迫特性的轉基因植株，為采用生物技術手段對銅污染土壤進行植物修復提供了一種新思路。

參考文獻：

[1]Yruela I. Copper in plants：acquisition，transport and interactions[J]. Functional Plant Biology，2009，36（5）：409-430.

[2]Weber M B，Schat H，Ten Bookum-van der Maarel W M. The effect of copper toxicity on the contents of nitrogen compounds in Silene vulgaris（moench） garcke[J]. Plant and Soil，1991，133（1）：101-109.

[3]Vinit-Dunand F，Epron D，Alaoui-Sossé B，et al. Effects of copper on growth and on photosynthesis of mature and expanding leaves in cucumber plants[J]. Plant Science，2002，163（1）：53-58.

[4]Lombardi L，Sebastiani L. Copper toxicity in Prunus cerasifera：growth and antioxidant enzymes responses of in vitro grown plants[J]. Plant Science，2005，168（3）：797-802.

[5]Mittler R. Oxidative stress，antioxidants and stress tolerance[J]. Trends in Plant Science，2002，7（9）：405-410.

[6]張紅曉，張芬琴. 銅在植物細胞中的運輸和分布[J]. 洛陽理工學院學報（自然科學版），2011，21（3）：1-5.

[7]Zhang B，Stellwag E J，Pan X. Large-scale genome analysis reveals unique features of microRNAs[J]. Gene，2009，443（1/2）：100-109.

[8]Lee R C，F(xiàn)einbaum R L，Ambros V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14[J]. Cell，1993，75（5）：843-854.

[9]Reinhart B J，Slack F J，Basson M，et al. The 21-nucleotide let-7 RNA regulates developmental timing in Caenorhabditis elegans[J]. Nature，2000，403（6772）：901-906.

[10]Llave C，Kasschau K D，Rector M A，et al. Endogenous and silencing-associated small RNAs in plants[J]. The Plant Cell，2002，14（7）：1605-1619.

[11]Mette M F，Van Der Winden J，Matzke M，et al. Short RNAs can identify new candidate transposable element families in Arabidopsis[J]. Plant Physiology，2002，130（1）：6-9.

[12]Park W，Li J，Song R，et al. CARPEL FACTORY，a Dicer homolog，and HEN1，a novel protein，act in microRNA metabolism in Arabidopsis thaliana[J]. Current Biology，2002，12（17）：1484-1495.

[13]Reinhart B J，Weinstein E G，Rhoades M W，et al. MicroRNAs in plants[J]. Genes & Development，2002，16（13）：1616-1626.