王昭云 那冬晨

摘要 [目的]優(yōu)化馬齒莧ISSR-PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。[方法]以馬齒莧為試驗(yàn)材料，采用改良的CTAB法提取總DNA，對(duì)ISSR-PCR引物進(jìn)行篩選，同時(shí)進(jìn)行ISSR-PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的優(yōu)化，電泳檢測(cè)ISSR-PCR產(chǎn)物。[結(jié)果]8個(gè)ISSR引物適合馬齒莧的ISSR-PCR分析；最適反應(yīng)體系為總體系25.0 μL，其中2×Taq Platinum PCR Master Mix 12.5 μL，10 μmol/L引物2.0 μL，40 mg/L DNA模板1.0 μL，ddH2O 9.5 μL；最適反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性360 s；

94 ℃變性60 s，54 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s，30次循環(huán)；72 ℃再延伸300 s。[結(jié)論]建立了馬齒莧ISSR-PCR擴(kuò)增的最佳反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序，為進(jìn)一步研究馬齒莧提供基礎(chǔ)資料。

關(guān)鍵詞 馬齒莧；ISSR-PCR；反應(yīng)體系；反應(yīng)條件

中圖分類(lèi)號(hào) S647 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2017）13-0147-02

Optimization of ISSR-PCR Reaction System and Reaction Condition of Portulaca oleracea L.

WANG Zhao-yun1，NA Dong-chen1，2 *

（1.Modern College of Arts and Sciences，Shanxi Normal University， Linfen，Shanxi 041000；2.College of Life Sciences，Shanxi Normal University，Linfen，Shanxi 041000）

Abstract [Objective]To optimize ISSR-PCR reaction system and reaction condition of Portulaca oleracea L.[Method]Taking P.oleracea L.as the research object，using improved CTAB method to extract total DNA of P.oleracea L.，the ISSR-PCR primers were screened，at the same time ISSR-PCR reaction system and reaction condition were optimized to test ISSR-PCR products by electrophoresis.[Result]Eight primers were suitable for ISSR-PCRof P.oleracea L..The optimal reaction system was that total reaction system 25.0 μL，including 12.5 μL 2×Taq Platinum PCR Master Mix，2.0 μL 10 μmol/L primers，1.0 μL 40 mg/L DNA templates，9.5 μL ddH2O.The optimal reaction condition was that pre-degeneration at 94 ℃ for 360 s，going to 30 cycles：degeneration at 94 ℃ for 60 s，annealing at 54 ℃ for 60 s，extension at 72 ℃ for 90 s，then extension at 72 ℃ for 300 s after 30 cycles.[Conclusion]The optimizing ISSR-PCR reaction system and reaction condition of P.oleracea L.were established to provide basis for further study P.oleracea L..

Key words Portulaca oleracea L.；ISSR-PCR；Reaction system；Reaction condition

馬齒莧（Portulaca oleracea L.）為馬齒莧科馬齒莧屬一年生草本植物，藥食兩用[1]。全株無(wú)毛，莖紫紅色，圓柱形，平臥或斜倚，伏地鋪散，葉互生，有時(shí)近對(duì)生，葉片扁平，肥厚，倒卵形，頂端圓鈍或平截，有時(shí)微凹，基部楔形，全緣[2]。馬齒莧適應(yīng)性強(qiáng)，適宜在溫暖、濕潤(rùn)、肥沃的壤土或沙壤土中生長(zhǎng)，耐旱亦耐澇，生于田野路邊及庭園廢墟等向陽(yáng)處，國(guó)內(nèi)各地均有分布。

ISSR是在簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR）基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的新型分子標(biāo)記，由加拿大蒙特利爾大學(xué)的Zietkiewicz等[3]提出。ISSR綜合了其他分子標(biāo)記高多態(tài)性、可重復(fù)性、低成本、易操作以及無(wú)需知道基因組序列等優(yōu)點(diǎn)[4-5]，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于鑒定種質(zhì)、分析遺傳關(guān)系、構(gòu)建遺傳圖譜等研究[6]。該研究以馬齒莧為試驗(yàn)材料，對(duì)影響ISSR-PCR反應(yīng)體系的各因素進(jìn)行優(yōu)化，建立馬齒莧ISSR-PCR擴(kuò)增的最佳反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序，為進(jìn)一步研究馬齒莧提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料。

馬齒莧，采于山西省臨汾市汾河公園，該地處于半干旱、半濕潤(rùn)的氣候區(qū)，屬暖溫帶大陸型氣候，冬寒夏熱，四季分明，雨熱同期。

1.1.2 化學(xué)試劑。CTAB、NaCl 、EDTA-Na2·2H2O、Tris、冰乙酸、硼酸、氯仿（三氯甲烷）、異戊醇、無(wú)水乙醇、NaOH、HCl（濃）、ddH2O、ISSR引物（20個(gè)引物）來(lái)自北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司，2×Taq Platinum PCR Master Mix、Gene Green核酸染料、Mark D2000，購(gòu)自北京天根生化科技有限責(zé)任公司。

1.2 方法

1.2.1 總DNA的提取與檢測(cè)。采用改良的CTAB法提取馬齒莧葉片總DNA。1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所提總DNA的質(zhì)量。

1.2.2 ISSR引物。

參考相關(guān)的文獻(xiàn)資料，初步選取810、823、824、825、826、827、834、835、842、844、847、848、855、857、861、862、864、866、869、870作為候選引物（表1）。

1.2.3 ISSR-PCR反應(yīng)體系。確定馬齒莧ISSR-PCR反應(yīng)體系，同時(shí)對(duì)上述20個(gè)候選引物進(jìn)行篩選。反應(yīng)體系共250 μL：2×Taq Platinum PCR Master Mix 9.0～13.0 μL，引物（10 μmol/L）0.5～2.5 μL，ddH2O 6.5～14.5 μL，DNA（40 mg/L）1.0～3.0 μL。

1.2.4 ISSR-PCR反應(yīng)條件。

確定馬齒莧ISSR-PCR反應(yīng)條件，反應(yīng)條件如下：

94 ℃預(yù)變性360 s；94 ℃變性60 s，50～56℃退火40～90 s，72 ℃延伸50～100 s，循環(huán)30次；72 ℃再延伸300 s。

2 結(jié)果與分析

2.1 總DNA的提取

根據(jù)馬齒莧總DNA電泳圖譜可知，提取的DNA完整性好，條帶清晰且明亮，沒(méi)有拖尾和降解的現(xiàn)象，符合PCR擴(kuò)增的模板要求。

2.2 ISSR-PCR結(jié)果

經(jīng)過(guò)反復(fù)試驗(yàn)，最終得到馬齒莧ISSR-PCR最適反應(yīng)體系和反應(yīng)條件。反應(yīng)體系共25.0 μL：2×Taq Platinum PCR Master Mix 12.5 μL，引物（10 μmol/L）2.0 μL，ddH2O 9.5 μL，DNA（40 mg/L）1.0 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性360 s；94 ℃變性60 s，54 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s，循環(huán)30次；72 ℃再延伸300 s。馬齒莧ISSR-PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。

參考何正文等[7]文獻(xiàn)資料，依據(jù)譜帶的強(qiáng)弱及雜帶多少對(duì)PCR擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行分析。從圖2可以看出，引物2～9（864、866、869、870、847、848、855、857）的擴(kuò)增條帶穩(wěn)定，重復(fù)性好，特異性好，清晰明亮，861、862等引物的擴(kuò)增條帶出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，條帶不清晰，剩余大部分引物的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果也均有譜帶出現(xiàn)，但條帶較弱或重復(fù)性不好。

3 討論與結(jié)論

ISSR步驟多、流程長(zhǎng)，從DNA提取到引物篩選和PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件的優(yōu)化，每一步驟都至關(guān)重要，是一個(gè)多因素影響的綜合體系[8]。提取DNA的質(zhì)量不符合要求，引物、反應(yīng)體系和反應(yīng)條件不合適等[9]都可能導(dǎo)致沒(méi)有條帶或條帶不清晰、重復(fù)性不好等結(jié)果。為確保ISSR分析結(jié)果的正確性及可重復(fù)性，需要對(duì)反應(yīng)體系、反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)引物進(jìn)行篩選[10]。

該試驗(yàn)從以下幾方面進(jìn)行了優(yōu)化：①總DNA提取的最佳方案。完整、高質(zhì)量的DNA是獲得重復(fù)性好、準(zhǔn)確可靠的ISSR-PCR結(jié)果的保證。文獻(xiàn)中有關(guān)植物核DNA的提取方法很多，其中以Doyle和Domle（1987年）提出的CTAB法應(yīng)用最為廣泛。改良CTAB法相比傳統(tǒng)CTAB法在步驟上有所簡(jiǎn)化，所得到的基因組DNA純度高，蛋白質(zhì)、酚類(lèi)及多糖等雜質(zhì)去除較完全，其純度和濃度均達(dá)到了ISSR-PCR反應(yīng)的要求[11]。

②最佳反應(yīng)體系。該試驗(yàn)優(yōu)化所得馬齒莧ISSR-PCR的反應(yīng)體系如下：總反應(yīng)體系為25.0 μl，其中2×Taq Platinum PCR Master Mix 12.5 μL，引物（10 μmol/L）2.0 μL，ddH2O 9.5 μL，DNA（40 mg/L）1.0 μL。③最佳反應(yīng)條件。該試驗(yàn)優(yōu)化所得馬齒莧ISSR-PCR的反應(yīng)條件為預(yù)變性94 ℃ 360 s；94 ℃變性60 s，54 ℃退火60 s，72 ℃ 延伸90 s，30次循環(huán)；72 ℃再延伸300 s。

試驗(yàn)結(jié)果表明：篩選的8個(gè)ISSR引物、優(yōu)化的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件適于馬齒莧ISSR-PCR分析及相關(guān)分子生物學(xué)研究。

參考文獻(xiàn)

[1] 崔國(guó)靜，楊祎，賀薔.馬齒莧的來(lái)源與功效[J].首都醫(yī)藥，2013（23）：41-42.

[2] 周滿生，徐菁，王國(guó)華.值得推廣的特色蔬菜——馬齒莧[J].現(xiàn)代園藝，2013（9）：33-34.

[3] ZIETKIEWICZ E，RAFALSKI A，LABUDA D.Genome fingerprinting by simple sequence repeat（SSR）-anchored polymerase chain reaction amplification[J].Genomics，1994，20（2）：176-183.

[4] AGA E，BEKELE E，BRYNGELSSON T.Inter-simple sequence repeat（ISSR）variation in forest coffee trees （Coffea arabica L.）populations from Ethiopia [J].Genetica，2005，124（2）：213-221.

[5] SYAMKUMAR S，SASIKUMAR B.Molecular marker based genetic diversity analysis of Curcuma species from India [J].Scientia horticulturae，2007，112（2）：235-241.

[6] 趙謙，杜虹，莊東紅.ISSR分子標(biāo)記及其在植物研究中的應(yīng)用[J].分子植物育種，2007，5（S1）：123-129.

[7] 何正文，劉運(yùn)生，陳立華，等.正交設(shè)計(jì)直觀分析法優(yōu)化PCR條件[J].湖南醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1998，23（4）：403-404.

[8] 金鳳，陳崇順，鄒愛(ài)蘭，等.月季ISSR反應(yīng)體系的優(yōu)化[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006（1）：72-75.

[9] 劉美，趙桂琴，劉歡，等.早熟禾ISSR反應(yīng)體系的優(yōu)化[J].中國(guó)草地學(xué)報(bào)，2009，31（5）：107-111.

[10] BAO R，HU Y P，WANG L，et al.Optimization of ISSR-PCR system and primer screening for Blysmus sinocompressus[J].Chin J Grassland，2014，36（6）：46-52.

[11] 沙偉，滕兆巖，倪紅偉.正交設(shè)計(jì)優(yōu)化星星草ISSR-PCR反應(yīng)體系研究[J].中國(guó)草地學(xué)報(bào)，2006，28（6）：52-55.