何艷麗 王延輝 陳方園 孫平飛 徐年軍

摘要 [目的]研究滸苔代謝產物的提取方法。[方法]以滸苔為研究對象，用不同的細胞破碎方式、溶劑提取體系、料液比等對均一樣本的代謝產物進行提取，氣相色譜-質譜法（GC-MS）鑒定代謝產物成分，利用主成分分析等方法，對不同的代謝提取體系進行評價。[結果]溶劑體系甲醇-三氯甲烷-水（7∶3∶3）和液氮處理-球磨破碎-超聲波的破壁方法提取并鑒定出81種代謝產物，該方法具有高提取產率、高重現(xiàn)性、易操作和速度快等優(yōu)點。[結論]溶劑體系甲醇-三氯甲烷-水（7∶3∶3）和液氮處理-球磨破碎-超聲波破壁是適合滸苔代謝物提取的方法，該方法可為滸苔及大型綠藻的代謝組學研究提供參考。

關鍵詞 滸苔；提取方法；氣相色譜-質譜；代謝產物

中圖分類號 S986.2 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）13-0072-04

Metabolite Profiling of Seaweed Enteromorpha Using Gas Chromatography-Mass Spectrometry

HE Yan-li1，2， WANG Yan-hui1， CHEN Fang-yuan1， XU Nian-jun2* et al

（1. School of Pharmaceutical Engineering， Zhejiang Pharmaceutical College， Ningbo， Zhejiang 315100； 2. School of Marine Sciences， Ningbo University， Ningbo， Zhejiang 315211）

Abstract [Objective] To study the extraction method of Enteromorpha metabolites. [Method] Enteromorpha as the research object， using different cell crushing methods， solvent extraction system， solid-liquid ratio， the homogeneous sample metabolites were extracted； the metabolites were identificated by GC-MS； using principal component analysis method， different metabolic extraction systems were evaluated. [Result] A total of 81 metabolites were extracted and identified by the solvent system of methanol∶chloroform∶water （7∶3∶3） and liquid nitrogen treatment-milling-ultrasonic breaking method， showing high extraction yield， high reproducibility， easy operation and fast and other characteristics. [Conclusion] It is a suitable method for extracting metabolites of Enteromorpha which can provide reference for metabonomics study of Enteromorpha and large green algae.

Key words Enteromorpha；Extraction method；GC-MS；Metabolite

滸苔（Enteromorpha）亦稱苔條、苔菜，屬綠藻綱石莼科，為大型海洋綠藻，廣溫、廣鹽、耐干旱，在我國近海廣泛分布。在適合條件下容易出現(xiàn)爆發(fā)型增殖，給水產養(yǎng)殖造成嚴重困擾，其生態(tài)危害受到廣泛關注。同時滸苔又有較高的營養(yǎng)價值，滸苔“燒末吹鼻止衄血，湯浸搗敷手背腫痛”，具有軟堅散結、化痰消積、解毒消腫等作用；滸苔富含蛋白質、纖維素、碳水化合物和維生素等營養(yǎng)成分，在日韓等國家作為中高檔的佐料消費[1]，且價格昂貴。

滸苔在近海中的綠潮爆發(fā)極具規(guī)律：每年4、5月份在山東、江蘇、浙江等局部海域爆發(fā)，爆發(fā)期間對當?shù)厮a養(yǎng)殖造成極大損失[2]，對近海環(huán)境也產生不良影響，而其他時間附近海域則較少出現(xiàn)。關于其爆發(fā)機制以及如何減少其危害、提高對其有效利用仍需深入研究。近年來對滸苔的研究逐漸增多，但主要集中在其生理和繁殖狀態(tài)觀察方面[3-4]，滸苔綠潮爆發(fā)情況下，滸苔代謝組的研究還未見報道。

代謝組學為分析植物細胞活動、次生代謝網(wǎng)絡提供了依據(jù)[5-7]。近年來隨著相關數(shù)據(jù)處理軟件和植物代謝組數(shù)據(jù)庫的完善，代謝組學的應用成為植物代謝通路研究不可或缺的一部分，其提取方法直接影響試驗結果[8-9]，而不同物種的植物代謝產物具有一定的物種特異性，因此，建立并優(yōu)化基于氣相色譜-質譜法（GC-MS）的滸苔代謝產物提取方法很有必要。

筆者通過比較不同的細胞破碎方法和提取溶劑等提取因素，對適合滸苔水相代謝產物的提取方法進行優(yōu)化；通過該方法，測定并解析基于GC-MS的滸苔中基本的代謝圖譜，為后續(xù)的滸苔代謝組研究和類似的大型海洋綠藻的代謝組研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 主要試劑：三氯甲烷、正己烷、石油醚、甲醇、均為色譜級試劑，購自 Thermo Fisher公司；衍生化試劑N-甲基-三甲基硅基三氟乙酰胺（MSTFA），購自Aldrich。

主要儀器：GC-MS氣質聯(lián)用儀（Trace1300-ITQ900，賽默飛，美國）；色譜柱為TR-5ms 弱極性色譜柱（30 m×0.25 μm×0.25 mm）；JXFSTPRP-24球磨儀，上海凈信科技；CV200冷凍旋轉蒸干儀，北京艾吉姆。

1.2 方法

1.2.1 藻種及培養(yǎng)方法。

滸苔分離自象山港塔頭旺近海海域，加冰并在5 h內運輸至實驗室。正式試驗前進行純化培養(yǎng)，采用人工海水，鹽度30， f/2培養(yǎng)基（不加硅）加富，溫度為（25.0±0.5）℃，光照強度為 4 000 lx，光暗周期12 h∶12 h，隔天換水。

1.2.2 代謝物提取方法。2種細胞破碎方法：a.液氮研磨-超聲波；b.液氮處理-球磨破碎-超聲波。此處的液氮處理為樣品取出后，加入液氮用于酶等生物活性物質的滅活，不研磨。3種溶劑體系：①甲醇-三氯甲烷-水（7∶3∶3）；②甲醇-水（7∶3）；③甲醇-正己烷-三氯甲烷-水（1∶1∶1∶1）。采用上述2種破碎方法和3種溶劑體系提取滸苔代謝產物。

具體操作如下：準確稱取 20 mg滸苔凍干樣品（n=3），采用液氮研磨后，加入1 mL提取溶劑，冰浴超聲波1 min停頓1 min，重復10次。與3種溶劑組合后優(yōu)選出最佳溶劑組合后，分別結合3種細胞破碎方法，選擇最佳細胞破碎方式，最后進行料液比試驗。

1.2.3 GC-MS測試條件。柱前衍生，衍生條件：揮干有機相→加入50 μL甲氧氨基化試劑（甲氧氨基鹽酸鹽，20 mg/mL吡啶溶液）→30 ℃振蕩孵化90 min→加入90 μL MSTFA衍生化試劑→37 ℃恒溫孵化30 min→室溫放置2 h。

進樣口溫度250 ℃，不分流進樣，流速1.0 mL/min。程序升溫：50 ℃保留3 min，10 ℃/min 到250 ℃，保留5 min。傳輸線溫度250 ℃，EI源溫度230 ℃，質荷比35～500。

2 結果與分析

2.1 溶劑提取優(yōu)化

以提取代謝物種類、有效峰面積為指標，對不同的溶劑提取體系進行效果評價。液氮研磨后分別采用3種溶劑體系提取。結果如圖1和圖2所示，組合a②提取的物質較少，只有61種，a①和a③較多，溶劑體系①和③提取物質種類沒有顯著差異，但③中雜峰較多，有效峰面積僅為72%，因此，選擇①甲醇-三氯甲烷-水（7∶3∶3）作為提取溶劑。

2.2 細胞破碎方式的選擇及料液比優(yōu)化

以提取的代謝產物種類、有效峰面積和重現(xiàn)性為依據(jù)，對細胞破碎方式進行優(yōu)化。由圖3可以看出，液氮研磨-超聲波破碎細胞的提取物質種類較多，平均為82種，但其與液氮處理-球磨儀-超聲波處理方法提取的物質總數(shù)沒有顯著差異。

重現(xiàn)性：圖4中， b1～b8為同一組樣品的重復，a1～a9為同一樣品的重復。在主成分分析圖中，每個樣品數(shù)據(jù)對應一個點， 樣品數(shù)據(jù)越相似，其在主成分分析圖上對應的點之間的距離就越近，其集中程度反映了處理樣品重現(xiàn)性的高低。理想狀態(tài)下，b1～b8 和a1～a9分別集中在一起，從圖4可以看出，三角形和正方形分布于中間軸的兩側，說明2組差異顯著。b1～b8高度集中，而a1～a9分散于右邊半個區(qū)域，即方法a①組內差異明顯比方法b①大。這可能是液氮研磨是人工手動，當樣品數(shù)量多時，對人力消耗較大，造成研磨重現(xiàn)性差。另外，由于液氮研磨是將樣品直接置于研缽中，研磨過程會損耗一部分樣品，樣品量少的情況不適合用該種方法。球磨儀破碎和超聲波破碎細胞時，可以將樣品稱重后放EP管中，破碎后直接加入萃取溶劑，避免了二次轉移，減少了對樣品的損耗，對樣品量的要求降低。另外，利用球磨儀破碎時采用了批量處理，這應該是其組內差異小的原因之一。基于此，將樣品前期用液氮滅活，然后采用球磨儀和超聲波進行細胞破碎的方法是較好的代謝組細胞破壁方法。

2.3 滸苔代謝產物分析

經(jīng)Nist數(shù)據(jù)庫比對，結合已有文獻[5]和Massbank數(shù)據(jù)庫參考，分析并鑒定提取滸苔代謝產物81種。其中，氨基酸18種，含量占11.511%，涵蓋常見的必需氨基酸和非必需氨基酸；酸類24種，含量11.600%，主要是參與三羧酸循環(huán)的小分子羧酸，為重要的代謝組分；糖類10種，含量67.78%；另有芳香酸、醇類、萜、烯醇等。

3 結論與討論

通過比較不同的細胞破碎方法和提取溶劑等提取因素，發(fā)現(xiàn)選擇提取溶劑采用甲醇-三氯甲烷-水（7∶3∶3）；細胞破壁方法采用將樣品前期用液氮滅活，然后采用球磨儀和超聲波進行細胞破碎得到的代謝產物較多（81種），平行性和重復性都較另外幾種方法穩(wěn)定，GC-MS分離鑒定出24種酸、10種糖、18種氨基酸等物質。

溶劑提取方法的結果與張曉飛等[10]的研究結果相近，這說明植物中一部分代謝產物相對保守，但是3種溶劑的比例不同，可能因為這2種植物中的極性和非極性的代謝產物比例不同。該提取方法與分類提取的差異不大，有些甚至還由于單獨分類提?。喝琮R曉輝等[11]等提取滸苔多糖，最后得到12種，該試驗得到了10種；提取和分離鑒定的氨基酸中谷氨酸含量較高，這與徐大倫[12]的研究相近，并且該方法提取的氨基酸為18種，比徐大倫的提取方法多了1種；該方法分離鑒定出的24種酸中，其中亞麻酸含量較高，這與孫偉紅等[13]的研究結果相同。綜上，該方法對不同種類小分子代謝物得到了比較充分的提取，為進一步研究滸苔代謝奠定基礎。

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