黃天晴 王星然 王彥娜 孫慧智 韓英

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150030）

三倍體雌性虹鱒性腺發(fā)育過程中l(wèi)c3b 基因的表達(dá)分析

黃天晴 王星然 王彥娜 孫慧智 韓英

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150030）

旨在證明細(xì)胞自噬與三倍體雌性虹鱒性腺敗育的關(guān)系。利用RT-PCR 擴(kuò)增虹鱒自噬基因lc3b（Microtubule associated protein 1 light chain 3 beta，lc3b）的編碼區(qū)序列，通過透射電鏡觀察三倍體雌性虹鱒不同發(fā)育階段性腺中自噬小體的形態(tài)，結(jié)合不同發(fā)育階段性腺中l(wèi)c3b 基因和蛋白的表達(dá)，來證明細(xì)胞自噬的發(fā)生。結(jié)果表明，在200 dpf-270 dpf（Days post fertilization，dpf）這個(gè)發(fā)育階段，lc3b 基因以及自噬蛋白LC3B-II / LC3B-I的表達(dá)處于相對(duì)較高的水平，在這個(gè)時(shí)期內(nèi)，都觀察到了自噬體結(jié)構(gòu)的存在。這些結(jié)果證明了性腺細(xì)胞自噬為三倍體雌性虹鱒性腺敗育的主要原因之一。

三倍體；虹鱒；自噬；LC3B；性腺發(fā)育

虹鱒作為主要冷水性養(yǎng)殖魚類，其不育的雌性三倍體個(gè)體較二倍體具有更多的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，且能夠避免生殖死亡而得到廣泛應(yīng)用。然而，虹鱒雌性三倍體不育的調(diào)控機(jī)制至今還不十分明確，使其規(guī)模化育種受到限制。近年來，圍繞三倍體虹鱒性腺發(fā)育的組織學(xué)，細(xì)胞學(xué)開展了系列研究。實(shí)驗(yàn)表明，三倍體雌性虹鱒發(fā)育至受精后一段時(shí)間，卵泡敗育并且重新分化，出現(xiàn)類生精樣細(xì)胞，雌激素水平逐漸降低，雄激素水平逐漸升高，呈現(xiàn)了類雄性化的發(fā)育趨勢(shì)［1］。究竟是何種細(xì)胞過程導(dǎo)致了這種顛覆性的變化，還不得而知。

自噬是指一些需降解的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器等胞漿成分被包裹成自噬小體，并最終運(yùn)送至溶酶體降解的過程，為細(xì)胞再利用產(chǎn)生能量［2］。細(xì)胞在受到外界壓力與刺激時(shí)，細(xì)胞自噬會(huì)起到保護(hù)作用，消化與代謝掉細(xì)胞廢物從而維持在正常狀態(tài)［3］。同時(shí)，自噬也是一把雙刃劍，往往和細(xì)胞凋亡同時(shí)出現(xiàn)［4］。細(xì)胞凋亡和自噬被認(rèn)為是細(xì)胞死亡機(jī)制的連續(xù)部分，自噬為凋亡所必需，自噬與凋亡共同促進(jìn)細(xì)胞死亡［5］。細(xì)胞自噬過程在進(jìn)化過程中是高度保守的，用于降解并消除細(xì)胞中多余以及受損的結(jié)構(gòu)，例如線粒體等［6］。細(xì)胞自噬中最明顯的形態(tài)結(jié)構(gòu)是部分細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞器被雙層膜結(jié)構(gòu)的囊泡包裹起來，形成自噬小體，然后自噬小體與溶酶體結(jié)合，溶酶體中的水解酶成分可以將自噬小體內(nèi)的物質(zhì)降解［7］。細(xì)胞自噬的調(diào)控機(jī)制非常復(fù)雜，在酵母中已經(jīng)有30 多種自噬相關(guān)基因atg（Autophagy-related genes，atg）被鑒定出來［8］。細(xì)胞自噬對(duì)哺乳動(dòng)物的卵泡閉鎖起到重要的作用，在調(diào)節(jié)卵泡細(xì)胞重塑的過程中起到重要作用［9］。LC3B 蛋白為Atg8 在高等動(dòng)物中的對(duì)應(yīng)蛋白［10］。在細(xì)胞發(fā)生自噬時(shí)，水溶性的LC3B- Ⅰ轉(zhuǎn)變?yōu)橹苄缘腖C3B- Ⅱ，并結(jié)合到自噬小體膜上直到與溶酶體結(jié)合［11］。因此，LC3B 蛋白表達(dá)的水平高低在一定程度上可以反映細(xì)胞的自噬程度［12］。

在三倍體雌性虹鱒發(fā)育的過程中，性腺發(fā)生了重塑，為了驗(yàn)證細(xì)胞自噬在三倍體雌性虹鱒性腺敗育過程中起到的作用，本研究擬通過透射電鏡觀察不同發(fā)育階段性腺中自噬小體的形態(tài)，并檢測(cè)不同發(fā)育階段自噬基因lc3b 的表達(dá)，來證明細(xì)胞自噬的發(fā)生。利用Western blot 實(shí)驗(yàn)來檢測(cè)LC3B-II / LC3B-I的表達(dá)，闡述其主要的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與飼養(yǎng) 本實(shí)驗(yàn)的三倍體雌性虹鱒卵均按照Espinosa［13］的方法得到。三倍體雌性虹鱒與二倍體雌性虹鱒飼養(yǎng)于黑龍江水產(chǎn)研究所（哈爾濱）。受精后的虹鱒魚卵放置于10℃的孵育槽培養(yǎng)，直到受精后24 h 移至0.3 m3水箱內(nèi)，帶有水循環(huán)系統(tǒng)，水溫始終控制在（10+0.1）℃，光周期為12L∶12D。受精54 d 以后，魚苗被轉(zhuǎn)移到不同的水箱內(nèi)，恒定溫度為12℃，每天定時(shí)投喂虹鱒商業(yè)飼料。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 反轉(zhuǎn)錄試劑盒，PMD-18T 載體，rTaq 酶，限制性內(nèi)切酶均購于TaKaRa 公司，質(zhì)粒小提試劑盒，熒光定量試劑盒，DNA marker 與蛋白marker 購自全是金公司，膠回收試劑盒購于Axygen公司，Western blot 相關(guān)試劑配置于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)動(dòng)物遺傳育種實(shí)驗(yàn)室，透射電鏡相關(guān)試劑配置于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)電鏡中心?；驕y(cè)序由北京華大公司完成。

1.2 方法

1.2.1 總RNA 的提取與cDNA 的合成 用Trizol 試劑提取不同發(fā)育階段三倍體雌性虹鱒性腺中的總RNA，具體發(fā)育階段為180 dpf、200 dpf、220 dpf、 240 dpf、270 dpf、300 dpf 和360 dpf。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScriptRTReagent Kit，TaKaRa）說明書將各發(fā)育階段提取的總RNA 反轉(zhuǎn)為cDNA，存放于-20℃冰箱中。

1.2.2 虹鱒lc3b 基因編碼區(qū)的克隆 根據(jù)NCBI中提供的大西洋鮭lc3b 基因（GenBank 登錄號(hào)BT046065），利用Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增虹鱒lc3b 基因的編碼區(qū)序列。引物序列為（5'-3'）：F-CTGTAGACTCCGCAGCAGATAGC，RGGAAGACAGGGGGATAGGTCTG。反轉(zhuǎn)錄PCR 反應(yīng)體系為50 μL：cDNA 1 μL，引物 4 μL，rTaq 0.5 μL，10×PCR Buffer 5 μL，dNTPs 4 μL，dH2O 35.5 μL。PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃ 5 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，35 個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。PCR 產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠電泳中觀察結(jié)果，將目的條帶膠回收，連接PMD-18T 克隆載體進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 實(shí)時(shí)定量PCR Real-time PCR 檢測(cè)以上各發(fā)育階段三倍體雌性虹鱒性腺中l(wèi)c3b 基因的表達(dá)量。反應(yīng)體系為20 μL：上游引物 0.4 μL，下游引物 0.4 μL，SYBR Mix 10 μL，cDNA 1 μL，Dye Ⅱ 0.4 μL，dH2O 7.4 μL。ABI7500 儀器設(shè)定反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 34 s，40 個(gè)循環(huán)；95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s。檢測(cè)lc3b 基因表達(dá)的引物為（5'-3'）：F-AAGGAGGACATTTGAGCAGAGAG，RAGCTGCTTCTCTCCCTTGTATCTC。以β-acin基因作為內(nèi)參，引物序列為（5'-3'）：F-ATCCTGACGGAGCGCGGTTACAG，R-TGCCCATCTCCTGCTCAAAGTCCA。

1.2.4 透射電鏡 不同發(fā)育階段的虹鱒性腺樣本放置于固定液中（2.5% 戊二醛和2.5% 多聚甲醛），存放于4℃冰箱中過夜，然后用1% 的四氧化鋨溶液固定1 h。之后樣本用氧化丙烯脫水并固定于樹脂中，樣本進(jìn)行超薄切片，并放置于120 kV 的H-7650 透射電鏡（Hitachi，Japan）下進(jìn)行觀察。

1.2.5 Western blot 不同發(fā)育階段的虹鱒性腺組織蛋白被提取出來，加入SDS-PAGE 上樣緩沖液，煮沸20 min。通過SDS-PAGE 凝膠電泳將蛋白分離出來，并將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，洗膜之后，用脫脂乳37℃條件下封閉2 h。利用LC3B 抗體（Cell Signaling Technology，#2775）作為一抗進(jìn)行孵育過夜，之后利用rabbit anti-IgG conjugated to horseradish peroxidase（中杉金橋）作為二抗進(jìn)行孵育，2 h 后洗膜，最后進(jìn)行曝光得到特異條帶14 kD 和16 kD。

2 結(jié)果

2.1 虹鱒lc3b基因編碼區(qū)的序列分析

根據(jù)大西洋鮭lc3b 基因的編碼區(qū)序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增得到虹鱒lc3b 基因編碼區(qū)的片段為378 bp（圖1），經(jīng)序列測(cè)定后，與大西洋鮭的序列一致性達(dá)到93.07%。虹鱒lc3b 基因編碼126 個(gè)氨基酸，其基因序列被提交到GenBank 上，GenBank 登錄號(hào)為KX845472。

圖1 虹鱒lc3b基因編碼區(qū)PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 lc3b基因的同源性分析

在NCBI 上下載相關(guān)物種的lc3b 基因序列，包括人（Homo sapiens）、豬（Sus scrofa）、牛（Bos Taurus）、小鼠（Mus musculus）、大鼠（Rattus norvegicus）、雞（Gallus gallus）、葉吻銀鮫（Callorhinchus milii）、鯉魚（Cyprinus carpio）、斑馬魚（Danio rerio），以及大西洋鮭（Salmo salar）與虹鱒魚的lc3b 基因編碼區(qū)序列進(jìn)行比較。通過MEGA 6.06 軟件構(gòu)建Neighbor-Joining 進(jìn)化樹（圖2）。從進(jìn)化樹中可以看出，lc3b 基因在進(jìn)化過程中比較保守，虹鱒的lc3b 基因與大西洋鮭落于同一分支中，屬于鮭科，大西洋鮭屬。

圖2 lc3b基因系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

2.3 LC3B蛋白的預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)分析

利用Swiss-model 軟件將虹鱒LC3B 蛋白的氨基酸序列與其中搜索到人的Microtubule-associated proteins 1A/1B light chain 3B（PDB number：2zjd.2.A）蛋白模板進(jìn)行比對(duì)（圖3），在這基礎(chǔ)上預(yù)測(cè)虹鱒LC3B 蛋白的三維結(jié)構(gòu)（圖4）。二者蛋白的序列一致性達(dá)到了92.05%，結(jié)構(gòu)相似性為56%。

圖3 虹鱒LC3B蛋白的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖

2.4 三倍體虹鱒各發(fā)育階段性腺組織亞顯微結(jié)構(gòu)的觀察

為了驗(yàn)證三倍體雌性虹鱒性腺發(fā)育過程中卵泡細(xì)胞發(fā)生自噬的情況，通過透射電鏡對(duì)性腺進(jìn)行了觀察，在發(fā)育到200 dpf 個(gè)體的性腺中可觀察到自噬小體的結(jié)構(gòu)，是由雙層或多層膜構(gòu)成的囊狀結(jié)構(gòu)，其中包含著完整或者正在消化中的細(xì)胞器，包括核糖體，高爾基體等。一直持續(xù)到270 dpf，在200 dpf-270 dpf 這個(gè)發(fā)育階段中均可觀察到自噬小體的存在。在這個(gè)發(fā)育階段的二倍體雌性虹鱒性腺中，透射電鏡可觀察到完整的卵母細(xì)胞結(jié)構(gòu)，細(xì)胞膜比較完整，有比較清晰的細(xì)胞核結(jié)構(gòu)，并沒有類似自噬小體的結(jié)構(gòu)出現(xiàn)（圖5）。通過比較，可以發(fā)現(xiàn)三倍體雌性虹鱒的性腺發(fā)育過程中出現(xiàn)異常，卵泡細(xì)胞中有自噬體結(jié)構(gòu)出現(xiàn)。

2.5 lc3b在三倍體雌性虹鱒各發(fā)育階段性腺中

mRNA表達(dá)水平分析

針對(duì)三倍體雌性虹鱒性腺發(fā)育過程中出現(xiàn)自噬小體的情況，檢測(cè)lc3b 基因在發(fā)育各階段的性腺中的表達(dá)。在160 dpf-200 dpf 這個(gè)發(fā)育階段，虹鱒雌性三倍體性腺中l(wèi)c3b mRNA 水平的表達(dá)量相對(duì)較低，但在220 dpf-270 dpf 這個(gè)階段，該基因的表達(dá)出現(xiàn)了顯著的升高，較發(fā)育初期的表達(dá)有顯著的差異（P<0.05）。在之后的發(fā)育階段，直到360 dpf，基因表達(dá)又恢復(fù)了到了發(fā)育初期水平（圖6）。這與透射電鏡觀察到自噬小體存在的階段基本一致。

2.6 LC3B-Ⅱ/ LC3B-Ⅰ在三倍體虹鱒各發(fā)育階段

性腺中的表達(dá)

為了更深入的驗(yàn)證三倍體雌性虹鱒性腺發(fā)育過程中自噬現(xiàn)象，驗(yàn)證LC3B 的蛋白表達(dá)水平。LC3B蛋白有兩種形式，LC3B- Ⅰ和LC3B- Ⅱ。細(xì)胞中沒有自噬發(fā)生時(shí)，該蛋白以LC3B- Ⅰ的形式存在與細(xì)胞質(zhì)中，而細(xì)胞自噬發(fā)生時(shí)，該蛋白以LC3B- Ⅱ的形式存在與自噬小體膜上，因此LC3B- Ⅱ / LC3B-Ⅰ 的比例往往可以代表自噬水平的高低。通過檢測(cè)不同發(fā)育階段三倍體雌性虹鱒性腺中蛋白的表達(dá)，表明LC3B- Ⅱ / LC3B- Ⅰ的表達(dá)比在200 dpf-270 dpf這個(gè)發(fā)育階段始終處于較高的水平（圖7），即這一階段細(xì)胞自噬也處于較高的水平。

圖4 虹鱒LC3B蛋白與Swiss-model模板蛋白氨基酸序列對(duì)比圖

圖5 透射電鏡觀察二、三倍體雌性虹鱒不同發(fā)育階段性腺的亞顯微結(jié)構(gòu)

圖6 lc3b基因在三倍體雌性虹鱒各發(fā)育階段性腺組織中的表達(dá)

圖7 LC3B蛋白在三倍體雌性虹鱒各發(fā)育階段的表達(dá)

3 討論

在本研究中，細(xì)胞自噬與三倍體雌性虹鱒性腺發(fā)育異常被聯(lián)系了起來。首先，克隆了虹鱒自噬基因lc3b 的編碼區(qū)序列。通過透射電鏡觀察三倍體雌性不同發(fā)育階段性腺的亞顯微結(jié)構(gòu)，確定了自噬小體的存在。檢測(cè)不同發(fā)育階段自噬基因lc3b 的表達(dá)，基因的表達(dá)結(jié)果與自噬小體出現(xiàn)的時(shí)期基本吻合。對(duì)于檢測(cè)三倍體雌性虹鱒不同發(fā)育階段性腺中自噬蛋白的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在200 dpf-270 dpf 階段，性腺細(xì)胞自噬水平比較強(qiáng)烈。以前的研究表明，在這一階段之后，性腺組織發(fā)生纖維化，導(dǎo)致發(fā)育異常。因此，性腺細(xì)胞自噬是導(dǎo)致三倍體雌性虹鱒性腺發(fā)育異常的主要原因之一。

自噬是廣泛存在于真核細(xì)胞中的生命現(xiàn)象，貫穿于正常細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育和生理病理過程，目前已在高等哺乳動(dòng)物和植物細(xì)胞的研究中取得較大的進(jìn)展，特別是在酵母細(xì)胞自噬的研究中更是不斷深入［14］。但是目前對(duì)魚類細(xì)胞自噬的研究才剛剛開始，對(duì)其在控制魚類細(xì)胞分化、生長(zhǎng)發(fā)育和防治病原感染等方面的研究還不多。多倍體魚類由于其具有較多的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)與經(jīng)濟(jì)價(jià)值，因此對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育的機(jī)制研究有一定的遺傳學(xué)意義。在哺乳動(dòng)物的卵泡發(fā)育和閉鎖過程中，細(xì)胞自噬起到重要的作用。在硬骨魚類的研究，排卵之后的卵巢組織發(fā)生了重塑，是卵泡細(xì)胞的自噬與凋亡一起協(xié)同作用的結(jié)果［15，16］。在我們之前的研究中［1，17］，發(fā)現(xiàn)三倍體雌性虹鱒的性腺發(fā)生敗育，雌性化特征減弱，性腺發(fā)生了重塑，因此這里我們將卵泡細(xì)胞的自噬與其性腺敗育聯(lián)系在一起進(jìn)行研究。

通過透射電鏡對(duì)三倍體雌性虹鱒性腺的亞顯微結(jié)構(gòu)觀察，我們發(fā)現(xiàn)了自噬小體結(jié)構(gòu)。具有多層膜包圍，內(nèi)部具有完整的或者正在消化中的細(xì)胞器，這與魚類閉鎖的以及排卵后的卵巢中觀察到的自噬體結(jié)構(gòu)相似［18］。自噬調(diào)節(jié)信號(hào)通路復(fù)雜，在酵母菌中的研究較為透徹，自噬活動(dòng)又是十分保守的細(xì)胞活動(dòng)，在不同物種中的調(diào)節(jié)機(jī)制較為相似［19］。我們克隆了虹鱒的自噬基因lc3b 的編碼區(qū)片段為378 bp，并通過進(jìn)化樹分析虹鱒lc3b 基因序列與大西洋鮭的序列高度保守，并落在同一分支內(nèi)。對(duì)于虹鱒LC3B 蛋白三維結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)，與已知的人Microtubule-associated proteins 1A/1B light chain 3B（PDB number：2zjd）的蛋白結(jié)構(gòu)具有很高的相似性。通過對(duì)三倍體雌性虹鱒不同發(fā)育階段性腺中l(wèi)c3b 基因表達(dá)進(jìn)行分析，表明該基因在200 dpf-270 dpf 階段始終處于較高的表達(dá)水平。

然而在細(xì)胞自噬的研究中，LC3B 的蛋白水平高低是證明細(xì)胞自噬水平高低的有效手段。LC3B蛋白有兩種形式，LC3B- Ⅰ和LC3B- Ⅱ。細(xì)胞中沒有自噬發(fā)生時(shí)，該蛋白以LC3B- Ⅰ的形式存在與細(xì)胞質(zhì)中，而細(xì)胞自噬發(fā)生時(shí)，該蛋白以LC3B- Ⅱ的形式存在與自噬小體膜上，因此LC3B- Ⅱ / LC3B-Ⅰ的比例往往可以代表自噬水平的高低［20］。通過Western blot 實(shí)驗(yàn)我們證明了在200 dpf-270 dpf 發(fā)育階段，三倍體雌性虹鱒性腺中LC3B- Ⅱ / LC3B- Ⅰ的表達(dá)水平很高，證明性腺細(xì)胞在這過程中發(fā)生了強(qiáng)烈的自噬，性腺發(fā)育異常，導(dǎo)致性腺敗育。

因此我們推測(cè)卵泡細(xì)胞的自噬，是導(dǎo)致三倍體雌性虹鱒性腺重新分化的主要原因，是導(dǎo)致三倍體雌性虹鱒不育的重要機(jī)制。

4 結(jié)論

本研究克隆了虹鱒lc3b 基因的編碼區(qū)序列。通過透射電鏡觀察與分析lc3b 基因及LC3B 蛋白在三倍體雌性虹鱒性腺不同發(fā)育階段的表達(dá)水平，證明了性腺細(xì)胞自噬為三倍體雌性虹鱒性腺敗育是主要原因之一。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Expression Analysis of lc3b Gene in Gonadal Development of Triploid Female Rainbow Trout

HUANG Tian-qing WANG Xing-ran WANG Yan-na SUN Hui-zhi HAN Ying
（Department of Animal Science and Technology，Northeast Agricultural University，Harbin 150030）

This work aims to show a new light on the relationship between autophagy and gonadal regression of triploid female rainbow trout. Autophagy gene lc3b of rainbow trout was cloned by RT-PCR，and its expressions in gonads of triploid female rainbow trout were analyzed at different developmental period in mRNA and protein level. Gonadal ultrastructures were observed under transmission electron microscopy. Results showed clear evidence that lc3b gene was highly expressed in gonads of triploid female rainbow trout during the period of 200dpf to 270 dpf，in which autophagosome structures were identified. In this stage，the conversion of LC3B-I to LC3B-II was greater. These results demonstrated autophagy played pivotal roles in gonadal regression of triploid female rainbow trout.

triploid；rainbow trout；autophagy；LC3B；gonadal development

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016-1166

2016-12-24

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31470131）

黃天晴，女，博士研究生，研究方向：水產(chǎn)動(dòng)物育種與繁殖；E-mail：tianqing88@126.com

韓英，女，博士，研究方向：水產(chǎn)動(dòng)物育種與繁殖；E-mail：hanying_606@163.com