鐘儉鴻殷瑜陳代杰

（1. 華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院，上海 200237；2. 上海交通大學(xué)藥學(xué)院，上海 200240；3. 上海來益生物藥物研究開發(fā)中心有限責(zé)任公司，上海 201203）

乙醇誘導(dǎo)對鼠李糖乳桿菌HCCB 20591代謝乙醛的影響

鐘儉鴻1，3殷瑜2，3陳代杰1

（1. 華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院，上海 200237；2. 上海交通大學(xué)藥學(xué)院，上海 200240；3. 上海來益生物藥物研究開發(fā)中心有限責(zé)任公司，上海 201203）

乙醛是酒類飲品中的風(fēng)味物質(zhì)，但乙醛過高不僅會影響酒類飲品的風(fēng)味，還會對人體產(chǎn)生潛在的危害。從可食用的益生菌中篩選可以代謝乙醛的菌株，并探究活性菌株的乙醛代謝能力跟乙醇誘導(dǎo)的關(guān)系。通過靜息細(xì)胞法篩選獲得的鼠李糖乳桿菌HCCB 20591具有較強代謝乙醛的能力，且其代謝能力受乙醇誘導(dǎo)。當(dāng)乙醇誘導(dǎo)濃度為3%，誘導(dǎo)時間為12 h時，乙醛轉(zhuǎn)化率達(dá)到41.13%。GC-MS分析其代謝產(chǎn)物除了乙酸外，還生成了乙醇。采用Real time RT-PCR方法分析相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平，發(fā)現(xiàn)乙醛代謝是乙醇脫氫酶、乙醛脫氫酶和醛氧化還原酶綜合催化作用的結(jié)果。

鼠李糖乳桿菌；乙醇誘導(dǎo)；乙醛代謝；綜合催化作用

乙醛是酒類飲品中普遍存在的風(fēng)味物質(zhì)［1］，還在紅酒的著色中起作用［2］，其主要由酵母菌代謝乙醇產(chǎn)生［3］。但乙醛過高不僅會影響酒類飲品的風(fēng)味，還會對人體產(chǎn)生潛在的危害［4］。GB31640-2016規(guī)定食用酒精中醛的含量應(yīng)小于30 mg/L，但是研究發(fā)現(xiàn)我國成品白酒中乙醛的平均含量經(jīng)常遠(yuǎn)超出規(guī)定值，高者可達(dá)173.24 mg/L［5］。研究如何降低白酒中的乙醛含量具有重要的意義。

乳酸菌作為益生菌對人體是有益的，在維持腸道內(nèi)菌群的平衡，抑制內(nèi)毒素分泌，增強免疫，改善肝功能等方面具有重要作用［6-8］。部分腸道乳桿菌，如鼠李糖乳桿菌Lactobacillus rhamnosus ATCC5 3103和發(fā)酵乳桿菌Lactobacillus fermentum MG590具有代謝乙醛的活性［9，10］，一些乳制品中的乳桿菌也具有代謝乙醛的活性［11］。但是，關(guān)于乙醇誘導(dǎo)對乳桿菌代謝乙醛影響的研究卻鮮有報道。

本研究試圖從可食用的益生菌中篩選具有代謝乙醛能力的乳酸菌，并通過對其相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平分析，推測活性益生菌的乙醛代謝能力與乙醇誘導(dǎo)相關(guān)性的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌株 實驗所用到的菌株：干酪乳桿菌Lactobacillus casei HCCB 20533，羅伊氏乳桿菌Lactobacillus reuteri HCCB 20534、HCCB 20594，嗜酸乳桿菌Lactobacillus acidophilus HCCB 20535、HCCB 20559、HCCB 20592、HCCB 20597，保加利亞乳桿菌Lactobacillus bulgaricus HCCB 20540、HCCB 20560，植物乳桿菌Lactobacillus plantarum HCCB 20553、HCCB 20554，鼠李糖乳桿菌Lactobacillus rhamnosus HCCB 20555、HCCB 20591、HCCB 20598、HN001，均由上海來益生物藥物研究開發(fā)中心保藏。

1.1.2 試劑與培養(yǎng)基 胰蛋白胨和酵母提取物購自O(shè)xoid公司；40%乙醛購自天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；其他均為國產(chǎn)分析純試劑。

菌體培養(yǎng)基為MRS培養(yǎng)基：胰蛋白胨 10 g，牛肉膏 10 g，酵母提取物 5 g，葡萄糖 20 g，乙酸鈉 5 g，檸檬酸銨 2 g，吐溫80 1 g，磷酸氫二鈉 2 g，一水硫酸錳 0.03 g，瓊脂15 g，定容至1L，pH4.3，121℃，15 min滅菌，備用。根據(jù)需要加入適當(dāng)濃度的乙醇。

1.1.3 試劑盒 細(xì)菌總RNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒購自Thermo Scientific Fermentas；SYBR Green Real-Time qPCR試劑盒購自Roche。

1.1.4 主要儀器與設(shè)備 Centrifuge 5417R 臺式離心機和Mastercycler ep PCR儀購自Eppendorf公司；ABI 7500 Real time-PCR System購自ABI公司；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）7890A-5975C購自美國安捷倫公司。

1.2 方法

1.2.1 菌體細(xì)胞的培養(yǎng)與菌懸液的制備 將菌株從甘油管中接種至MRS培養(yǎng)基內(nèi)，37℃過夜生長，獲得預(yù)培養(yǎng)液；然后將預(yù)培養(yǎng)液按1%的接種量接至不含乙醇及含不同乙醇濃度（1%、3%、5%）的MRS培養(yǎng)基內(nèi)，37℃靜置培養(yǎng)3-18 h。取出菌液，離心，去上清；PBS（10 mmol/L，pH7.5）洗滌菌體兩次，再重懸菌體，調(diào)整菌懸液濃度約為3×109CFU/mL［9］；獲得的菌懸液用于代謝乙醛。

1.2.2 平板菌落計數(shù)法測定菌濃 將待測樣品用新鮮MRS培養(yǎng)基稀釋，吸取10-4、10-5和10-6的稀釋菌懸液各100 μL于平皿中，倒入融化后冷卻至45℃左右的MRS培養(yǎng)基，混勻，37℃培養(yǎng)48 h。取出平板，計算同一稀釋度3個平板上的菌落數(shù)，按下列公式計算菌濃：

每毫升中菌落形成單位（CFU）=同一稀釋度3次重復(fù)的平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×10

1.2.3 乙醛的靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化 取900 μL經(jīng)過不同條件培養(yǎng)獲得的菌株的PBS菌懸液與300 μL 1%的乙醛溶液混合，于37℃，220 r/min的反應(yīng)條件下培養(yǎng)2 h［9］；以不加菌懸液的反應(yīng)作為陰性對照。反應(yīng)結(jié)束后，12 000 r/min離心反應(yīng)液5 min，上清用于檢測乙醛的殘留量。文中所有生物代謝實驗均重復(fù)3次，取其平均值。

1.2.4 具有乙醛代謝活性的益生菌株篩選 選取15株益生菌，分別在有氧、無氧條件下，在無添加以及添加5%乙醇的MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)15 h后，收集菌體細(xì)胞用于乙醛轉(zhuǎn)化，用化學(xué)法檢測乙醛的含量。

1.2.5 分析方法 乙醛化學(xué)定量檢測方法參見文獻(xiàn)［12］。乙醛及其代謝產(chǎn)物的GC-MS檢測方法參見文獻(xiàn)［13］。

1.2.6 細(xì)菌總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 采用細(xì)菌總RNA提取試劑盒分別提取不同培養(yǎng)條件下獲得的菌體的總RNA，參考RNAprep Pure Cell/Bacteria Kit 產(chǎn)品說明書去除總RNA中的基因組DNA，依據(jù)如下公式：RNA濃度=（A260-A280）×稀釋倍數(shù)×0.04 μg/μL，測定總RNA的濃度。使用Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒中的隨機引物將1 μg的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，得到cDNA并置于-80℃冰箱備用。

1.2.7 Real time RT-PCR 選擇乙醇脫氫酶基因（alcohol dehydrogenase，adh）、乙醛脫氫酶基因（aldehyde dehydrogenase，aldh）和醛氧化還原酶基因（aldehyde oxidoreductase，aor）進(jìn)行mRNA轉(zhuǎn)錄水平分析，以鼠李糖乳桿菌L. Rhamnosus ATCC 53103內(nèi)源穩(wěn)定表達(dá)的16S RNA基因［14］作為內(nèi)參基因。根據(jù)L. Rhamnosus ATCC 53103基因組（GenBank號：NC_013198.1）設(shè)計用于熒光定量PCR擴增目標(biāo)片段的引物序列，由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。引物特征見表 1。反應(yīng)體系10 μL及反應(yīng)程序均按照Roche公司SYBR Green Real-Time qPCR試劑盒說明書操作，每個反應(yīng)設(shè)3個重復(fù)。采用相對定量的Comparative Delta-delta Ct方法，分析目的基因相對表達(dá)量。

表1 Real time RT-PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1 具有乙醛代謝活性的益生菌株的篩選

不同培養(yǎng)條件下各菌株代謝乙醛情況結(jié)果（圖1）顯示，鼠李糖乳桿菌L. Rhamnosus HCCB 20591代謝乙醛活性最為突出，且乙醇的存在顯著增強其乙醛代謝活性，乙醛轉(zhuǎn)化率為26.01%，為無乙醇誘導(dǎo)時的3.61倍。因此，后繼實驗選定在有乙醇誘導(dǎo)培養(yǎng)的L. Rhamnosus HCCB 20591作進(jìn)一步的研究。2.2 不同乙醇誘導(dǎo)濃度的影響

不同乙醇濃度誘導(dǎo)HCCB 20591 15 h后，菌體細(xì)胞代謝乙醛的情況如圖2所示。從圖中可以看出乙醇誘導(dǎo)濃度為3%時，代謝乙醛活性最大，乙醛轉(zhuǎn)化率為34.69%。因此，確定3%為最適乙醇誘導(dǎo)濃度。

2.3 不同乙醇誘導(dǎo)時間的影響

將HCCB 20591接種到乙醇濃度為3%的培養(yǎng)基中，每3 h用平板菌落計數(shù)法測定菌濃并用化學(xué)檢測法檢測菌體代謝乙醛的活性。結(jié)果如圖3所示，誘導(dǎo)時間12 h時，HCCB 20591代謝乙醇的活性最大，乙醛轉(zhuǎn)化率為41.13%。相比無乙醇培養(yǎng)15 h時，轉(zhuǎn)化率提高了5.69倍。因此，確定乙醇濃度3%，誘導(dǎo)時間12 h為合適的誘導(dǎo)條件。

2.4 乙醛代謝產(chǎn)物的GC-MS分析

圖1 不同培養(yǎng)條件下益生菌靜息細(xì)胞代謝乙醛的情況

圖2 乙醇誘導(dǎo)濃度對HCCB 20591靜息細(xì)胞代謝乙醛能力的影響

采用GC-MS分析HCCB 20591經(jīng)不同乙醇濃度誘導(dǎo)12 h后代謝乙醛的產(chǎn)物（表2），發(fā)現(xiàn)HCCB 20591代謝乙醛生成乙酸的同時也生成了乙醇，且菌體轉(zhuǎn)化乙醛的量和生成乙酸、乙醇的量與乙醇的誘導(dǎo)有關(guān)。3%乙醇誘導(dǎo)時，菌體轉(zhuǎn)化乙醛的量和生成乙醇的量最多。

2.5 乙醛代謝相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平分析

從2.4的結(jié)果可看出，乙醛的代謝途徑不單一，可能涉及多個酶。本研究通過對ATCC 53103的基因組分析，發(fā)現(xiàn)aor基因編碼的醛氧化還原酶（AOR）、adh基因編碼的乙醇脫氫酶（ADH）和aldh編碼的乙醛脫氫酶（ALDH）可能參與了乙醛代謝。其中，AOR催化乙醛還原為乙醇，ADH催化乙醇氧化為乙醛，ALDH催化乙醛氧化為乙酸。進(jìn)一步對aor、 adh和aldh基因進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄水平分析（表3），可以看出，3個基因都有乙醇誘導(dǎo)表達(dá)現(xiàn)象存在，但不同乙醇濃度誘導(dǎo)下其表達(dá)量不同，這可能是導(dǎo)致HCCB 20591代謝乙醛的量、生成乙酸和乙醇的量出現(xiàn)差異的主要原因。

圖3 HCCB 20591菌濃以及代謝乙醛能力隨誘導(dǎo)時間的變化情況

3 討論

乙醛作為揮發(fā)性的風(fēng)味物質(zhì)在酒中起重要作用。酒中乙醛濃度偏高成為我國釀酒行業(yè)普遍面臨的難題。本研究對15株益生菌的靜息細(xì)胞代謝乙醛的能力進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)HCCB 20591具有較強的代謝乙醛的能力，并且這種能力與乙醇誘導(dǎo)有關(guān)。經(jīng)過對乙醇誘導(dǎo)條件的選擇，HCCB 20591乙醛轉(zhuǎn)化率達(dá)到41.13%。這意味著HCCB 20591代謝酒中的乙醛是可行的。其部分代謝乙醛的能力既可以降低乙醛濃度，又不至于完全改變乙醛帶來的風(fēng)味，具有潛在的應(yīng)用價值。

ALDH作為參與乙醛降解主要的酶，廣泛存在于微生物中［15］。利用具有乙醛生物降解功能的微生物降解乙醛成為酒精性疾病預(yù)防的研究重點［16］。Kim等［10］研究發(fā)現(xiàn)Lactobacillus fermentum MG-590具有ADH 和ALDH 活性，能降解乙醇，緩解由乙醇引起的肝細(xì)胞損傷。另外，也有研究發(fā)現(xiàn)ADH、AOR在催化乙醛轉(zhuǎn)化時起作用［17，18］。本研究通過對可能涉及HCCB 20591代謝乙醛過程的3個基因（adh、aldh和 aor）進(jìn)行Real time RT-PCR分析，發(fā)現(xiàn)HCCB 20591代謝乙醛是ADH、ALDH和AOR綜合作用的結(jié)果，隨乙醇誘導(dǎo)濃度而變化，代謝的產(chǎn)物既有乙酸，也有乙醇。

表2 GC-MS分析HCCB 20591經(jīng)不同乙醇濃度誘導(dǎo)后代謝乙醛的情況

表3 不同乙醇濃度誘導(dǎo)12 h后HCCB 20591乙醛代謝相關(guān)基因的相對表達(dá)量

乙醇對乳桿菌代謝的影響涉及的因素比較多，如關(guān)鍵酶的活力、菌體存活率、細(xì)胞膜性質(zhì)等［19，20］。本研究主要從分子水平探討乙醇誘導(dǎo)對HCCB 20591代謝乙醛相關(guān)基因的影響，是否還有別的因素在乙醇誘導(dǎo)后菌體代謝乙醛的過程中起作用有待進(jìn)一步探究。

4 結(jié)論

HCCB 20591具有較強的代謝乙醛的能力，并且這種能力與乙醇誘導(dǎo)有關(guān)。當(dāng)乙醇誘導(dǎo)濃度為3%，誘導(dǎo)時間為12 h時，乙醛轉(zhuǎn)化率達(dá)到41.13%。HCCB 20591代謝乙醛是ADH、ALDH和AOR綜合作用的結(jié)果。

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（責(zé)任編輯 朱琳峰）

Effect of Ethanol-induction on the Metabolism of Acetaldehyde in Lactobacillus rhamnosus HCCB 20591

ZHONG Jian-hong1，3YIN Yu2，3CHEN Dai-jie1
（1. School of Biotechnology，East China University of Science and Technology，Shanghai 200237；2. School of Pharmacy，Shanghai Jiao Tong University，Shanghai 200240；3. Shanghai Laiyi Center for Biopharmaceutical R&D，Shanghai 201203）

Acetaldehyde is a flavor substance in alcoholic beverages. Excessive acetaldehyde not only affects the flavor of alcoholic beverages，but also causes health damages to human body. This study is to screen edible probiotic strains with the ability to metabolize acetaldehyde，and explore the relationship between acetaldehyde metabolism and ethanol-induction. Strain HCCB 20591 of Lactobacillus rhamnosus with strong acetaldehyde metabolism ability was obtained via a resting cell system，and its metabolic ability was induced by ethanol. When the ethanol concentration was 3% and the induction time was 12 h，the acetaldehyde conversion ratio by HCCB 20591 was 41.13%. GC-MS analysis of the acetaldehyde metabolites showed that in addition to acetic acid，ethanol was also generated by HCCB 20591. RT-PCR method was used to analyze the transcription level of the related genes. It was found that acetaldehyde metabolism was the combined catalytic result of alcohol dehydrogenase，aldehyde dehydrogenase and aldehyde oxidoreductase.

Lactobacillus rhamnosus；ethanol-induction；acetaldehyde metabolism；combined catalytic result

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0051

2017-01-24

鐘儉鴻，男，在讀碩士研究生，研究方向：發(fā)酵工程微生物；E-mail：906269707@qq.com

陳代杰，男，博士，研究方向：微生物藥物的開發(fā)；E-mail：hccb001@163.com