祝杰+李廷陽(yáng)+陸明雄+莫?jiǎng)儆?馮佳佳+陸欽晨+陸萬(wàn)流

【摘要】 目的 觀察大鼠實(shí)驗(yàn)性腦出血血腫周?chē)X組織中C-IAP-1和Caspase-3的表達(dá)變化及瑞舒伐他汀的干預(yù)作用，探討瑞舒伐他汀在腦出血發(fā)生后可能出現(xiàn)的神經(jīng)保護(hù)作用及其機(jī)制。

方法 將60只SD大鼠按照隨機(jī)分組的方法分為假手術(shù)組（A組，20只），腦出血組（B組，20只），瑞舒伐他汀干預(yù)組（C組，20只）。每組分成6 h、24 h、72 h、5 d四個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)使用5只大鼠進(jìn)行造模并實(shí)驗(yàn)。采用自體凝固動(dòng)脈血注入腦組織法建立腦出血模型。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)測(cè)定大鼠腦出血術(shù)后4個(gè)時(shí)間點(diǎn)血腫腦組織C-IAP-1及Caspase-3表達(dá)狀況。

結(jié)果 熒光定量PCR法顯示，假手術(shù)組、腦出血組與瑞舒伐他汀組術(shù)后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)相比，C-IAP-1及Caspase-3表達(dá)降低，除第6小時(shí)外，其余時(shí)間點(diǎn)之間腦出血組和瑞舒伐他汀干預(yù)組相比，C-IAP-1表達(dá)降低，Caspase-3表達(dá)增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

結(jié)論 瑞舒伐他汀可以提高C-IAP-1的水平，抑制Caspase-3的水平，提示瑞舒伐他汀能夠降低由細(xì)胞凋亡影響引起的繼發(fā)性腦損傷，對(duì)神經(jīng)功能起到一定的保護(hù)作用。

【關(guān)鍵詞】 腦出血；C-IAP-1；Caspase-3；瑞舒伐他汀

中圖分類(lèi)號(hào)：R743.34 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2017.03.006

【Abstract】 Objective To observe the change of expression of C-IAP-1 and Caspase-3 in brain tissue around hematoma in rats with experimental intracerebral hemorrhage and the intervention effect of rosuvastatin，and to investigate the neuroprotective effect and possible mechanism of rosuvastatin after intracerebral hemorrhage.

Methods 60 SD rats were randomly divided into sham operation group （group A，20 rats），intracerebral hemorrhage group （group B，20 rats） and rosuvastatin group （group C，20 rats）.Each group was divided into four time points：6 h，24 h，72 h and 5 d，and 5 rats were used for modeling and experiment at each time point.Cerebral hemorrhage model was established by injecting autologous blood into the brain tissue.And the expressions of C-IAP-1 and Caspase-3 in the brain tissue of rats at the 4 time points after intracerebral hemorrhage were measured by RT-qPCR.

Results RT-qPCR showed that expressions of C-IAP-1 and Caspase-3 reduced in the comparison of each time point of the three groups after operation.Expected the 6 h，the expression of C-IAP-1 decreased and the expression of Caspase-3 increased in the cerebral hemorrhage group and the rosuvastatin intervention group at the other time points，so difference was statistically significant（P<0.05）.

Conclusion Rosuvastatin can improve the level of C-IAP-1，and inhibit the effects of Caspase-3，which suggests that rosuvastatin can reduce the secondary brain damage caused by apoptosis，and play a certain role in the protection of nerve function.

【Key words】 intracerbral hemorrhage；C-IAP-1；Caspase-3；rosuvastain

腦出血（Intracerebral Hemorrhage ，ICH）作為神經(jīng)外科常見(jiàn)疾病，病情一般比較危重，情況較為緊急。目前研究表明在東亞地區(qū)中腦出血占腦卒中的比例為25%～55%，在西方國(guó)家中相對(duì)較少，也達(dá)到了10%～15%。有報(bào)道指出腦出血發(fā)病30天內(nèi)的死亡率高達(dá)40%左右[1]，存活下來(lái)的大部分患者致殘的概率也達(dá)到75%～80%。目前腦出血后繼發(fā)腦損傷的機(jī)制尚未完全闡明，有研究表明出血后引起細(xì)胞應(yīng)激，繼而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是重要原因之一。在細(xì)胞凋亡過(guò)程中Caspase-3被認(rèn)為起到關(guān)鍵作用[2]，正常細(xì)胞中Caspase-3沒(méi)有活性，其在接收到外界刺激信號(hào)后，凋亡程序啟動(dòng)[3]，凋亡開(kāi)始。凋亡抑制蛋白（inhibitors of Apoptosisprotein，IAPs）主要抑制Caspase3，-7，其可以結(jié)合酶原Caspase，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡[4]。有研究表明瑞舒伐他汀能夠通過(guò)對(duì)血管內(nèi)皮功能改善、免疫功能調(diào)節(jié)、抗炎作用等方面阻止興奮性毒性細(xì)胞損傷，在一定程度上抑制細(xì)胞凋亡。目前針對(duì)瑞舒伐他汀干預(yù)下C-IAP-1和Caspase-3在腦出血后表達(dá)變化的研究較少，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)大鼠進(jìn)行自體凝固血造模，并在瑞舒伐他汀干預(yù)下分析大鼠腦出血后C-IAP-1和Caspase-3表達(dá)變化，初步探討瑞舒伐他汀對(duì)兩種細(xì)胞因子的影響，為臨床治療尋找新的可靠方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SPF級(jí)雄性Wistar大鼠60只，體重250～300 g，由武漢云克隆科技股份有限公司（許可證號(hào)：SCXK 鄂 2015-0018）提供；瑞舒伐他汀鈣片購(gòu)自阿斯利康藥業(yè)（中國(guó)）有限公司；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit購(gòu)自Thermo公司；FastStart Universal SYBR Green Master（Rox）購(gòu)自Roche公司；熒光定量PCR儀（ABI，型號(hào)：7300）；超微量分光光度計(jì)（Thermo，型號(hào)：NanoDrop2000）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及給藥

將60只大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表分為假手術(shù)組（A組），腦出血組（B組）以及瑞舒伐他汀干預(yù)組（C組）三組，每組20只大鼠。其中每組分成4個(gè)時(shí)間點(diǎn)，6 h、24 h、72 h、5 d，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各5只大鼠。B組和C組采用自體凝固動(dòng)脈血注入法，通過(guò)立體定位儀向成年SD大鼠右側(cè)基底節(jié)區(qū)的尾狀核注入凝固自體血，A組采取相同方法注入等量滅菌生理鹽水[5～6]。術(shù)后2小時(shí)按照每kg體重10 mg比例對(duì)C組進(jìn)行灌胃治療，每天給藥一次至造模結(jié)束。其余兩組同時(shí)給予相同量的生理鹽水。

1.2.2 模型的建立

大鼠術(shù)前禁食禁水6小時(shí)，麻醉方式選用10%水合氯醛（350 mg/kg）腹腔注射。尾部采血50 μL，靜止5分鐘至血液完全凝固。大鼠頭頂部行正中縱向切口，30%過(guò)氧化氫腐蝕骨膜暴露前囟及進(jìn)針點(diǎn)。立體定位儀選定靶點(diǎn)，靶點(diǎn)定位于前囟前1 mm、中線左側(cè)旁開(kāi)3 mm、顱骨外表面下6 mm。進(jìn)針點(diǎn)處顱骨用顱骨鉆鉆一個(gè)直徑1 mm圓孔至硬腦膜表面，微量注射器將凝固血塊快速注入靶點(diǎn)內(nèi)[7～8]（圖1），注射速度20 μL/min，留針10 min后取針縫合。A組尾部取血，開(kāi)顱但不注入自體血，采用相同方法注入等量生理鹽水。C組造模后2小時(shí)，灌胃給予瑞舒伐他?。?0 mg·kg-1·d-1）1次，A組和B組在相同時(shí)間給予等量的生理鹽水。模型制備成功的標(biāo)準(zhǔn)是手術(shù)后可見(jiàn)大鼠出現(xiàn)明顯的對(duì)側(cè)肢體癱瘓，同時(shí)沿針道冠狀切面切開(kāi)腦組織，可發(fā)現(xiàn)顱內(nèi)血腫形成。

1.2.3 動(dòng)物的處置、標(biāo)本采集 采用10%水合氯醛（350 mg/kg），對(duì)三組大鼠進(jìn)行腹腔麻醉，檢查麻醉效果即大鼠沒(méi)有痛覺(jué)反應(yīng)，麻醉成功后為防止大鼠窒息采用止血鉗夾住大鼠的下頜及舌防止窒息，取出血腫腦組織，統(tǒng)一放入液氮用于qPCR檢測(cè)。

1.2.4 引物的設(shè)計(jì)與合成 從NCBI網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫(kù)檢索基因序列后，由武漢擎科公司設(shè)計(jì)并合成，C-IAP-1上游引物：5-AGACAGAGTGAAGAGACGGCATC-3，下游引物：5-AGAGAGTTTTTGAAGACGCTGG-3，Caspase-3上游引物：5-GAAAGCCGAAACTCTTCATCAT-3，下游引物：5-ATGCCATATCATCGTCAGTTCC-3。

1.2.5 qPCR實(shí)驗(yàn)方法 ①總RNA抽提與逆轉(zhuǎn)錄：取腦組織充分碾磨后使用Trizol法提取腦組織中RNA，通過(guò)超微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度及純度，采用FastStart Universal SYBR Green Master（Rox）對(duì)總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA用于C-IAP-1和Caspase-3檢測(cè)。②qPCR檢測(cè)C-IAP-1和Caspase-3的表達(dá)：引物由武漢擎科創(chuàng)新生物科技有限公司設(shè)計(jì)并合成，PCR擴(kuò)增預(yù)變性為95℃下10 min，95℃下10 s，60℃ 20 s，74℃ 5 s，循環(huán)40次，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀型號(hào)為ABI 7300。③結(jié)果處理：采用ΔΔCT法，使用表達(dá)倍數(shù)=2-ΔΔCT表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用方差分析進(jìn)行多組間分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05，雙側(cè)檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 腦出血中C-IAP-1表達(dá) 假設(shè)A組6 h時(shí)間點(diǎn)為1，A組C-IAP-1相對(duì)定量數(shù)值變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），數(shù)值基本相同，B組和C組Caspase-3表達(dá)水平遠(yuǎn)高于A組（P<0.01）。C組C-IAP-1在72 h至5 d達(dá)到頂峰。C組與B組在各個(gè)相同時(shí)間點(diǎn)比較，除6 h時(shí)間點(diǎn)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，其余時(shí)間點(diǎn)C組C-IAP-1表達(dá)均較B組增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見(jiàn)表1，圖2。

2.2 腦出血中Caspase-3表達(dá) 假設(shè)A組6 h時(shí)間點(diǎn)為1，各時(shí)間點(diǎn)A組Caspase-3表達(dá)水平基本不變，B組和C組Caspase-3表達(dá)水平遠(yuǎn)高于A組（P<0.01）。B組Caspase-3逐漸升高，在24 h至72 h達(dá)到頂峰，之后下降。C組與B組在各個(gè)相同時(shí)間點(diǎn)比較，Caspase-3表達(dá)明顯減少（P<0.05或0.01）。見(jiàn)表2，圖3。

3 討 論

ICH血腫占位會(huì)導(dǎo)致周?chē)X組織損傷、缺血等，引起炎癥反應(yīng)以及出血產(chǎn)生的血液毒性物質(zhì)作用下誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而加重腦損傷程度，腦出血引起的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡在繼發(fā)性損傷中的作用日益受到重視[9]。

Caspase即半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶，其能夠介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。Caspases-3是Caspase家族重要的一員，作為終末剪切酶，Caspase-3在細(xì)胞凋亡中起到樞紐的作用，可以裂解DNA依賴(lài)性蛋白酶，通過(guò)改變其結(jié)構(gòu)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡產(chǎn)生[10]。目前認(rèn)為Caspase-3具有高度可變性，能夠自發(fā)激活或者通過(guò)級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活，一旦Caspase-3激活后，就會(huì)開(kāi)始對(duì)對(duì)應(yīng)的下游底物進(jìn)行切割，引起細(xì)胞凋亡。近年來(lái)鈣離子負(fù)載引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)受損導(dǎo)致細(xì)胞凋亡也越來(lái)越受到關(guān)注，研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)受損會(huì)引起胞質(zhì)內(nèi)Caspase-7轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)Caspase-12表達(dá)，Caspase-12會(huì)激活Caspase-3，也會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡發(fā)生[11]。

凋亡抑制蛋白是一種能夠通過(guò)抑制Caspase活性及對(duì)NF-κB進(jìn)行調(diào)節(jié)來(lái)抑制細(xì)胞凋亡的內(nèi)源性抗細(xì)胞凋亡因子家族，在對(duì)凋亡抑制蛋白（IAP）家族的研究中發(fā)現(xiàn)C-IAP-1可以結(jié)合并有效地抑制Caspase-3在參與細(xì)胞凋亡的部分功能。同樣，在體外實(shí)驗(yàn)表明，C-IAP-1可以特異結(jié)合Caspase-3，抑制Csapase-3的活性，總之，這些研究結(jié)果表明，C-IAP-1通過(guò)抑制Csapase-3，抑制細(xì)胞凋亡基因[12～13]。

瑞舒伐他汀是選擇性HMG-CoA還原酶抑制劑的一種，有研究表明瑞舒伐他汀可以起到神經(jīng)保護(hù)作用，通過(guò)對(duì)血管內(nèi)皮功能改善、免疫功能調(diào)節(jié)、抗炎作用等方面阻止興奮性毒性細(xì)胞損傷來(lái)降低神經(jīng)功能缺損[14]。Ridkerbm等人發(fā)現(xiàn)堅(jiān)持服用他汀類(lèi)藥物能夠減少缺血性腦卒中致死率[15～16]，他汀類(lèi)藥物能起到促進(jìn)血液循環(huán)，活血化瘀，保護(hù)腦功能的作用。

本研究通過(guò)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)大鼠腦出血后C-IAP-1和Caspase-3進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)A組C-IAP-1及Caspase-3表達(dá)在四個(gè)時(shí)間點(diǎn)基本不變，B組和C組C-IAP-1及Caspase-3表達(dá)遠(yuǎn)高于A組，說(shuō)明腦出血后引起的炎癥反應(yīng)、血液毒性等作用會(huì)提高Caspase-3表達(dá)，引起神經(jīng)細(xì)胞凋亡，加重腦組織損傷。B組Caspase-3逐漸升高，在24 h至72 h達(dá)到頂峰，說(shuō)明腦出血后會(huì)導(dǎo)致Caspase-3表達(dá)升高，腦損傷與時(shí)間有一定關(guān)系。C組C-IAP-1在72 h至5 d達(dá)到頂峰，說(shuō)明瑞舒伐他汀能夠促進(jìn)C-IAP-1的表達(dá)，起到保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用。C組與B組在各個(gè)相同時(shí)間點(diǎn)比較發(fā)現(xiàn)，C組Caspase-3表達(dá)水平比B組減少，除6 h時(shí)間點(diǎn)外，C組C-IAP-1表達(dá)水平均較B組增多。說(shuō)明瑞舒伐他汀在腦出血發(fā)生后可以抑制Caspase-3表達(dá)，促進(jìn)C-IAP-1表達(dá)，能夠起到抑制細(xì)胞凋亡，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，減少腦損傷的作用。

總之，Caspase-3及C-IAP-1在腦出血后引起細(xì)胞凋亡中扮演著重要的作用，瑞舒伐他汀能夠提高C-IAP-1水平，降低Caspase-3水平起到神經(jīng)保護(hù)作用。但瑞舒伐他汀對(duì)C-IAP-1和Caspase-3表達(dá)影響的機(jī)制尚未完全闡明，隨著研究的逐漸深入，其影響的機(jī)制也將逐漸清晰，最終將為腦出血治療增添一個(gè)高效的治療手段。

參 考 文 獻(xiàn)

[1] 官 念，吳碧華，劉黎明，等.腦出血病因及相關(guān)機(jī)制的研究進(jìn)展[J].中華老年心腦血管病雜志，2016，18（6）：670-672.

[2] Keiko Takaki，Yoshihiro Higuchi，Minako Hashii，et al.Induction of apoptosis associated with chromosomal DNA fragmentation and caspase-3 activation in leukemia L1210 cells by HO2 nanoparticles[J].Journal of Bioscience and Bioengineering，2014，117（1）：129-133.

[3] 蔡 麗，周煉紅.Caspase與視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡的研究進(jìn)展[J].臨床眼科雜志，2016，24（4）：380-383.

[4] 吳志偉，陳 凱，段衛(wèi)明，等.凋亡抑制蛋白XIAP和Survivin在晚期胃癌中的表達(dá)及其與含多西紫杉醇方案化療療效的相關(guān)性[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2015，23（6）：815-820.

[5] 李新明，方顯明.安心顆粒對(duì)心衰大鼠血流動(dòng)力學(xué)及STAT3信號(hào)傳導(dǎo)通路的影響[J].廣西中醫(yī)藥，2010，33（3）：47-49.

[6] 朱文麗.大鼠實(shí)驗(yàn)性腦出血急性期Notch1與NF-κB的表達(dá)變化及他汀的干預(yù)作用[D].長(zhǎng)沙：中南大學(xué)，2014

[7] 阮志芳.大鼠腦內(nèi)注射凝血酶對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞活化及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶表達(dá)的影響[D].福州：福建醫(yī)科大學(xué)，2009.

[8] 呂田明，陸兵勛.大鼠尾狀核注射凝固自體動(dòng)脈血腦出血模型[J].中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，2006，23（1）：88-90，129.

[9] 王立姝.TLR4對(duì)大鼠腦出血后炎癥反應(yīng)和神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用研究[D].沈陽(yáng)：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)，2009.

[10] 傅錦華，劉 勇，王清勇，等.舒肝解郁膠囊對(duì)抑郁模型大鼠海馬神經(jīng)元凋亡及腦組織caspase-3蛋白表達(dá)的影響[J].中南大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2012，37（12）：1198-1204.

[11] 焦東亮，倪秀石，高 艷，等.丁苯酞對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后caspase-3表達(dá)的影響[J].中國(guó)臨床神經(jīng)科學(xué)，2007，15（1）：19-23.

[12] HUANG Li Hua，YANG Huan，SU Xin，et al.Neodymium Oxide Induces Cytotoxicity and Activates NF-κB and Caspase-3 in NR8383 Cells[J].Biomedical and Environmental Sciences，2017，30（1）：75-78.

[13] Karine Sá Ferreira，Clemens Kreutz，Sabine MacNelly，et al.Caspase-3 feeds back on caspase-8，Bid and XIAP in type I Fas signaling in primary mouse hepatocytes[J].Apoptosis，2014，17（5）：503-515

[14] 涂征艷，石 碩，李玉梅.化滯柔肝顆粒聯(lián)合瑞舒伐他汀鈣治療脂肪肝的療效觀察[J].中國(guó)醫(yī)藥科學(xué)，2012，2（23）：72-73.

[15] Sinar EJ，Mendelow AD，Graham DI，et al.Experimental intracerebral hemorrhage：effects of a temporary mass lesion[J].J Neurosurg，l987，66（4）：568-576.

[16] Ridker PM，Danielson E，F(xiàn)onseca FA，et al.Rosuvastatin to prevent vascular events in men and women with elevated C-reactive protein[J].N Engl J Med，2008，359（21）：2195-2207.

（收稿日期：2017-03-17 修回日期：2017-04-13）

（編輯：潘明志）