鄧桂明，何 海，葛金文*，肖小芹，陳 鎮(zhèn)，張志國，吳 萍，戴 冰，歐陽林旗，肖望重，向 彪

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，湖南 長沙 410208）

連芩解毒顆粒提取工藝研究

鄧桂明1,2，何 海1，葛金文2*，肖小芹2，陳 鎮(zhèn)1，張志國1，吳 萍1，戴 冰1，歐陽林旗1，肖望重1，向 彪1

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，湖南 長沙 410208）

目的優(yōu)選連芩解毒顆粒的最佳提取工藝。方法以鹽酸小檗堿及黃芩苷的轉(zhuǎn)移率為考察指標(biāo)，結(jié)合單因素及正交試驗法，對連芩解毒顆粒的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果優(yōu)選出連芩解毒顆粒的最佳提取工藝為：藥材用60%乙醇浸泡1.0 h，回流提取 2 次，第一次 1.5 h，料液比 1∶10（g∶mL），第二次 1 h，料液比 1∶8（g∶mL）。結(jié)論優(yōu)選的提取工藝穩(wěn)定、可行，為連芩解毒顆粒的生產(chǎn)制備提供實驗依據(jù)。

連芩解毒顆粒；正交試驗；提取工藝；鹽酸小檗堿；黃芩苷

連芩解毒顆粒原方為湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院耳鼻喉科協(xié)定制劑處方。由黃連、黃芩、黃芪等組成，具有清熱解毒，扶正培本之功效，用于鼻炎、咽炎、鼻咽癌及EB病毒陽性的鼻咽癌高危人群的抗病毒治療。本實驗根據(jù)方中各藥味的化學(xué)成分及藥理作用，以鹽酸小檗堿及黃芩苷的轉(zhuǎn)移率為考察指標(biāo)，結(jié)合單因素及正交試驗法，優(yōu)選最佳的提取工藝，為連芩解毒顆粒的研發(fā)提供實驗依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料

鹽酸小檗堿、黃芩苷對照品 (批號分別為110713-201009、100715-201002，供含量測定用，中國藥品生物制品檢定所)，制備連芩解毒顆粒所用藥材經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院張志國教授鑒定為正品，水為蒸餾水，流動相用色譜純試劑，其余所用試劑均為分析純。

1.2 儀器

Agilent1100系列高效液相色譜儀 (DAD檢測器，Agilent1100 工作站)；Adventurer TM SOPYJ-020萬分之一電子分析天平 (奧豪斯國際貿(mào)易上海有限公司)；KQ-600型超聲波清洗器(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)；DHG-9076A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；LH-1型電熱恒溫真空干燥箱 （上海醫(yī)療器械七廠）；SHB-III型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）。

2 方法與結(jié)果

圖1 連芩解毒顆粒HPLC圖

2.1 溶液制備

2.1.1 供試品溶液的制備[1]取已定容連芩解毒顆粒處方的醇提液，搖勻，精密量取25 mL，置蒸發(fā)皿中蒸干，放冷，加60%的乙醇50 mL，溶解，搖勻，濾過，精密量取2 mL續(xù)濾液，置5 mL量瓶中，加60%的乙醇至刻度，搖勻，即得。

2.1.2 混合對照品溶液的制備[1]分別精密稱取減壓干燥至恒重的鹽酸小檗堿對照品、黃芩苷對照品適量，置50 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，得質(zhì)量濃度分別為0.09 mg/mL、0.048 mg/mL的混合對照品溶液。

2.2 色譜條件

2.2.1 分析條件 色譜柱：KromasilC18(5 μm，250 mm×4.6 mm)；流動相：甲醇-0.1%磷酸水溶液（48∶52）； 檢測波長分別為 280 nm，345 nm； 流速1 mL/min；柱溫 30℃。

2.2.2 系統(tǒng)適用性試驗 將空白溶液、混合對照品溶液、供試品溶液及陰性供試品溶液依次進(jìn)樣10 μL，見圖1，結(jié)果表明空白溶液及陰性供試品溶液無干擾，混合對照品溶液及供試品溶液中各組分峰分離完全；理論塔板數(shù)按鹽酸小檗堿和黃芩苷計均在4 000以上。

2.3 方法學(xué)觀察

2.3.1 線性范圍 分別精密吸取上述混合對照品溶液 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0 mL，置 10 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別精密吸取10 μL，注入色譜儀，記錄色譜峰圖，以峰面積為y軸，進(jìn)樣量為x軸作回歸方程，得鹽酸小檗堿回歸方程為：Y=665.16X+8.026 5，r=0.999 9，黃芩苷回歸方程為：Y=1 014.0X-10.911，r=0.999 3；結(jié)果表明：鹽酸小檗堿、黃芩苷進(jìn)樣量分別在 0.018～0.18 μg、0.0096 μg～0.096 μg時，峰面積和進(jìn)樣量呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.3.2 精密性試驗 精密吸取同一混合對照品溶液10 μL，按照“2.2”項下色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣 6 次，記錄峰面積，鹽酸小檗堿、黃芩苷峰面積的RSD分別為2.02%、1.76%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗 分別于 0、2、4、6、8、24 h 精密吸取同一供試品溶液10 μL，注入色譜儀，記錄峰面積。鹽酸小檗堿、黃芩苷峰面積RSD分別為2.07%、2.63%。表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗 取同一批次藥材，精密稱定，平分6份，按“2.1”項下方法制備供試品溶液，按照“2.2”項下色譜條件測得鹽酸小檗堿、黃芩苷含量的RSD分別為1.39%、1.86%，表明方法重復(fù)性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗 精密量取6份各供試液1.0 mL，精密加入混合對照品溶液1.0 mL，搖勻，吸取10 μL注入色譜儀。計算鹽酸小檗堿、黃芩苷平均回收率為102.37%、96.72%,RSD為1.01%、1.04%。

2.4 實驗結(jié)果

2.4.1 提取方法的觀察 按處方量稱取五味藥材粗粉（90 g），用60%乙醇浸泡1.0 h后超聲提取兩次，第一次 1.5h，料液比 1∶10（g∶mL），第二次 1.0 h，料液比 1∶8（g∶mL）。 同理，選擇 60%乙醇為提取溶媒，回流提取 2 次，第一次 1.5h，料液比 1∶10（g∶mL），第二次 1.0 h，料液比 1∶8（g∶mL），按“2.1”項下方法制備供試品溶液并測定鹽酸小檗堿、黃芩苷的轉(zhuǎn)移率，比較回流法和超聲法的提取效果，見表1。

表1 提取方法考察

結(jié)果表明：回流法提取的鹽酸小檗堿、黃芩苷的轉(zhuǎn)移率比超聲法提取的均要高，提取方法以回流法較佳。

2.4.2 提取溶劑的考察 取藥材粗粉81 g，分別以蒸餾水，60%乙醇，按 “2.4.1”所述回流提取方法提取2次，分別測定鹽酸小檗堿、黃芩苷的轉(zhuǎn)移率，見表2。

表2 提取溶劑考察

結(jié)果表明：60%乙醇提取鹽酸小檗堿、黃芩苷的轉(zhuǎn)移率比蒸餾水提取均要高，且水提后得到的溶液黏度較大，含有較多的水溶性雜質(zhì)，對后續(xù)的過濾和濃縮會產(chǎn)生一定的影響，故選擇乙醇為提取溶劑。2.4.3 提取次數(shù)的觀察 在上述正交試驗優(yōu)選的工藝條件基礎(chǔ)上，增加一次提取，考察提取次數(shù)對浸出效果的影響，按處方量稱取五味藥材粗粉（90 g），第一次 1.5 h，料液比 1∶10（g∶mL），第二次 1 h，料液比1∶8（g∶mL），第三次 1h，料液比 1∶8（g∶mL），分別收集三次提取液，分別測定鹽酸小檗堿、黃芩苷的轉(zhuǎn)移率，結(jié)果見表3。

表3 提取次數(shù)考察

結(jié)果表明：第三次提取得到鹽酸小檗堿、黃芩苷的轉(zhuǎn)移率均小于三次提取總量的10%，故選擇提取兩次合理。

2.4.4 浸泡時間的觀察 取藥材粗粉81g，60%乙醇分別浸泡 0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h 后，按“2.4.1”所述回流提取方法提取2次，分別測定鹽酸小檗堿、黃芩苷的轉(zhuǎn)移率，結(jié)果見表4。

表4 浸泡時間考察

結(jié)果表明：延長浸泡時間對鹽酸小檗堿、黃芩苷的轉(zhuǎn)移率的影響變化不大，結(jié)合生產(chǎn)，選擇浸泡時間為1.0小時。

2.4.5 乙醇回流提取正交試驗考察 根據(jù)單因素考察結(jié)果，為進(jìn)一步優(yōu)化提取工藝，選擇乙醇濃度、乙醇用量、提取時間作為觀察因素，以鹽酸小檗堿、黃芩苷轉(zhuǎn)移率為評價指標(biāo)，進(jìn)行綜合評分[2]，用L9（34）正交表安排試驗。工藝因素水平見表5，正交設(shè)計與實驗結(jié)果見表6，方差分析見表7。

表5 提取工藝因素水平表

表6 正交設(shè)計與實驗結(jié)果

表7 方差分析表

正交設(shè)計與實驗結(jié)果表明，直觀分析極差可知，影響提取效果的因素順序為A＞B＞C，方差分析表表明，A、B 因素差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且 A、B 因素各水平間差異也有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而C因素差異無統(tǒng)計學(xué)意義 （P＞0.05），C 因素各水平間差異也統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），出于節(jié)省時間考慮，最終確定該復(fù)方的最佳提取工藝為A2B2C1，即最佳提取工藝條件為：五味藥材用60%的乙醇水溶液浸泡1.0 h，回流提取2次，第一次 1.5 h，料液比 1∶10（g∶mL），第二次 1 h，料液比1∶8（g∶mL）。

2.5 提取工藝的驗證實驗考察

根據(jù)提取工藝單因素實驗與正交試驗優(yōu)選的最佳提取工藝條件，擬定工藝驗證實驗，平行提取三份，分別測定鹽酸小檗堿、黃芩苷的轉(zhuǎn)移率為80.64%和77.47%，結(jié)果表明：該結(jié)果方法可取。

3 討論

中藥成分復(fù)雜、藥效各異，組成復(fù)方并非藥物簡單相加，因此對復(fù)方中藥一般采取復(fù)方提取[3-4]。本實驗在提取工藝設(shè)計前根據(jù)處方的功能、主治，通過文獻(xiàn)資料的查閱，分析每味中藥的有效成分與藥理作用；結(jié)合提取原理與預(yù)試驗結(jié)果，以君藥黃連中鹽酸小檗堿及臣藥黃芩中黃芩苷的轉(zhuǎn)移率為考察指標(biāo)，通過單因素考察及正交試驗，優(yōu)選最佳的提取工藝[5-6]。結(jié)果表明該法簡單、穩(wěn)定、可靠，可作為連芩解毒顆粒提取工藝。

本試驗結(jié)合單因素及正交試驗法，對連芩解毒顆粒的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化篩選，確認(rèn)連芩解毒顆粒的最佳提取工藝條件為：60%乙醇浸泡1.0 h，回流提取 2 次，第一次 1.5 h，料液比 1∶10（g∶mL），第二次1 h，料液比 1∶8（g∶mL）。 該工藝穩(wěn)定，可行，為該制劑的研制提供了科學(xué)的實驗依據(jù)。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010.285.

[2]任愛農(nóng),高 燃,田耀洲.多指標(biāo)綜合評分法優(yōu)選清清顆粒提取工藝[J].中成藥,2008,30（7）:1059-1062.

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[4]張 霞,王 榮,楊建宏,等.正交試驗法優(yōu)選復(fù)方蕓歸顆粒提取工藝[J].中國實驗方劑學(xué)雜志,2011,17(18):45-47.

[5]常占瑛,劉桂花,高曉黎,等.復(fù)方必清片的提取工藝優(yōu)選[J].中國實驗方劑學(xué)雜志,2013,19(22):51-55.

[6]曾 明,吳國海,邊佳明，等.舒通無糖顆粒制備工藝研究[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報,2012,9(24):121-123.

（本文編輯 李 杰）

Study on the Extraction Process of Lianqin Jiedu Granule

DENG Guiming1,2,HE Hai1,GE Jinwen2*,XIAO Xiaoqin2,CHEN Zhen1,ZHANG Zhiguo1,WU Ping1,DAI Bing1,OUYANG Linqi1,XIAO Wangzhong1,XIANG Biao1
(1.The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410007,China;2.The College of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine,Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China)

ObjectiveTo optimize the extraction technology of Lianqin Jiedu granules.MethodsThe transfer rate of berberine hydrochloride and baicalin rate as indexes,combined with single factor and orthogonal test method,the extraction process of Qinlian Jiedu granule was optimized.ResultsThe optimal extraction process was 60%ethanol immersion 1.0 h,reflux extraction 2 times,the first time 1.5 h,1∶10 (g∶mL),second time 1 h,1∶8 (g∶mL).ConclusionThe optimized extraction technology is stable and feasible,provide experimental basis for industrial production of Lianqin Jiedu granules.

Lianqin Jiedu granule;orthogonal test;extraction process;berberine;baicalin

R283.6

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2017.02.011

2015-11-30

湖南省科技廳博士后基金項目（2014RS4013）；2014年湖南省人力資源和社會保障廳博士后研究人員日常經(jīng)費資助項目；張志國全國名老中醫(yī)藥專家傳承工作室建設(shè)項目(國中醫(yī)藥人教教育〔2016〕。

鄧桂明，女，在站博士后，副主任藥師，碩士研究生導(dǎo)師，研究方向：藥物新劑型與新技術(shù)研究。

*葛金文,男，博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail:40831556@qq.com。

本文引用：鄧桂明，何 海，葛金文，肖小芹，陳 鎮(zhèn)，張志國，吳 萍，戴 冰，歐陽林旗，肖望重，向 彪.連芩解毒顆粒提取工藝研究[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2017，37（2）：157-159.