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        丹梔逍遙散對(duì)多囊卵巢大鼠血清T、AMH及卵巢局部AMH蛋白表達(dá)的影響

        2017-07-12 18:12:55侯麗瑩鄧麗玲余曦明全春梅楊正望
        關(guān)鍵詞:丹梔達(dá)英雄激素

        侯麗瑩,鄧麗玲,羅 佩,余曦明,全春梅,趙 娜,楊正望*

        (1.湖南中醫(yī)藥大學(xué),湖南 長沙 410208;2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科,湖南 長沙 410007)

        ·方藥研究·

        丹梔逍遙散對(duì)多囊卵巢大鼠血清T、AMH及卵巢局部AMH蛋白表達(dá)的影響

        侯麗瑩1,鄧麗玲1,羅 佩1,余曦明1,全春梅1,趙 娜1,楊正望2*

        (1.湖南中醫(yī)藥大學(xué),湖南 長沙 410208;2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科,湖南 長沙 410007)

        目的 探討丹梔逍遙散對(duì)多囊卵巢(polycystic ovaries,PCO)大鼠血清睪酮(testosterone,T)、抗苗勒管激素(anti-mulerian hormone,AMH)及卵巢局部AMH蛋白表達(dá)的影響。方法SD雌性大鼠以頸背部皮下注射脫氫表雄酮(dehydroepiandrostexone,DHEA)溶液構(gòu)建PCO大鼠模型,判定造模成功后再隨機(jī)分成模型組、達(dá)英-35組、丹梔逍遙散組,并設(shè)空白組,分別用蒸餾水、達(dá)英-35及丹梔逍遙散對(duì)大鼠灌胃給藥,連續(xù)灌胃21 d,停藥7 d為一療程,灌胃3個(gè)療程后處死大鼠,采用放射免疫法測(cè)定T、AMH,免疫組織化學(xué)法檢測(cè)PCO大鼠卵巢局部AMH蛋白表達(dá)。結(jié)果與模型組比較,丹梔逍遙散組血清T、AMH水平及AMH蛋白表達(dá)強(qiáng)度均下降 (P<0.01或P<0.05)。結(jié)論丹梔逍遙散治療高雄激素血癥 (hyperandrogenism,HA)可能是通過降低PCO大鼠血清T、AMH水平,降低卵巢局部AMH蛋白表達(dá)強(qiáng)度,對(duì)AMH進(jìn)行良性調(diào)節(jié),從而改善HA。

        多囊卵巢綜合征;高雄激素血癥;抗苗勒管激素;丹梔逍遙散;牡丹皮;梔子

        多囊卵巢綜合征 (polycystic ovary syndrome,PCOS)是育齡期常見的內(nèi)分泌代謝和生殖障礙疾病。高雄激素血癥(hyperandrogenism,HA)是引起PCOS患者局部病理變化的重要機(jī)制之一。近年來的基礎(chǔ)研究認(rèn)為卵巢局部微環(huán)境的失調(diào)是維持高雄激素血癥的重要機(jī)制。尤其是抗苗勒管激素水平(anti-mulerian hormone,AMH)作為一種卵巢局部重要調(diào)節(jié)因子,在PCOS患者中高表達(dá),成為診治和研究PCOS新的突破點(diǎn)。研究表明高雄激素的發(fā)生可能與AMH有一定的相關(guān)性,血清AMH濃度在PCOS合并HA婦女中更高[1-2]。

        既往PCOS的中醫(yī)藥治療研究大多以補(bǔ)腎活血化瘀為主要目標(biāo)進(jìn)行攻關(guān),相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究肯定了補(bǔ)腎活血方藥能夠改善PCOS[3]。隨著臨床研究的深入,以疏肝健脾清熱為切入點(diǎn)的中醫(yī)藥治療逐漸受到人們的關(guān)注,從肝論治PCOS高雄激素血癥也取得了一定成效。本研究立足于從肝論治,以卵巢局部微環(huán)境AMH與雄激素調(diào)節(jié)失常在HA形成中發(fā)揮作用為假說,通過運(yùn)用導(dǎo)師楊正望主任醫(yī)師常用方劑丹梔逍遙散干預(yù)多囊卵巢 (polycystic ovaries,PCO)大鼠模型,初步探討丹梔逍遙散對(duì)PCO大鼠血清T、AMH及卵巢局部AMH蛋白表達(dá)的影響,進(jìn)一步揭示其可能改善HA的作用機(jī)制。

        1 材料

        1.1 動(dòng)物

        21 d齡斷乳未成年雌性健康SD大鼠60只,SPF級(jí),體質(zhì)量(75±15)g,由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供,許可證號(hào)為:SCXK (湘)2011-0003,飼養(yǎng)在湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng),許可證號(hào)為:SYXK (湘)2013-0005。室溫20~26℃,相對(duì)濕度40%~60%,保持通風(fēng)干燥,標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料喂養(yǎng),自由進(jìn)食飲水。

        1.2 藥品和試劑

        丹梔逍遙散處方為:白術(shù)10 g,柴胡6 g,當(dāng)歸10 g,茯苓 15 g,甘草 5 g,牡丹皮 15 g,山梔 10 g,芍藥10 g,薄荷5 g,煨姜5 g。飲片購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院。先加蒸餾水浸泡30 min,水煎煮兩次,2次所得濾液混合后濃縮,生藥含量為0.91 g/mL,于4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。炔雌醇環(huán)丙孕酮片(商品名:達(dá)英-35,每片含醋酸環(huán)丙孕酮2 mg和炔雌醇 0.035 mg)由拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司提供,購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院。DHEA購自湖北芳通藥業(yè)有限公司,注射用大豆油購自蘇州捷易龍貿(mào)易有限公司,T、AMH放射免疫試劑盒購自北京華英生物技術(shù)研究所,AMH免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

        1.3 主要儀器

        RM2235輪轉(zhuǎn)石蠟切片機(jī)(德國LEIKA儀器有限公司),脫水機(jī)、包埋機(jī)(武漢俊杰電子有限公司),金迪YD-A生物組織攤片機(jī)(浙江金華市益迪醫(yī)療設(shè)備廠),DNP-9162電熱恒溫培養(yǎng)箱 (上海新苗醫(yī)療器械制造商有限公司),Motic BA410研究型顯微鏡 (麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)公司),Motic Images Plus 6.0計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)(麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)公司)。

        2 方法

        2.1 PCO大鼠模型的制備與評(píng)價(jià)[4-5]

        SD大鼠喂養(yǎng)至23 d齡后,按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為2組,即空白對(duì)照組20只,模型制備組40只。模型制備組每日上午10點(diǎn)頸背部皮下注射DHEA 0.06 g/(kg·d)+0.2 mL 注射油劑(大豆油),溶劑用量恒定為0.2 mL不變,由于每天每只大鼠均需稱量不等的DHEA單獨(dú)配制不同濃度的注射液,在此基礎(chǔ)上對(duì)DHEA注射液的配制進(jìn)行調(diào)整,按DHEA 0.06 g/(kg·d)+0.2 mL注射油劑 (大豆油)來換算。空白對(duì)照組20只,同期每日上午10點(diǎn)頸背部皮下注射0.2 mL注射油劑,連續(xù)20 d。每日稱體質(zhì)量,定期觀察攝食及活動(dòng)情況,注射10 d后開始每天下午4時(shí)進(jìn)行1次陰道脫落細(xì)胞學(xué)觀察,用光滑吸管吸取少量生理鹽水,沖入大鼠陰道內(nèi),吸取少量陰道液,涂于載玻片上直接光鏡觀察,觀察其動(dòng)情周期變化,陰道涂片顯示模型制備組大鼠光鏡下僅見大量白細(xì)胞,少量角化細(xì)胞提示一直處于動(dòng)情間期,失去規(guī)律性變化,無排卵;正常組仍保持規(guī)律的動(dòng)情周期。注射第20日當(dāng)晚8時(shí)禁食,次日晨起各組隨機(jī)抽取10只大鼠,頸椎脫臼法處死大鼠,解剖雙側(cè)卵巢,以卵巢最大平面作為待檢平面石蠟包埋,進(jìn)行HE染色觀察卵巢形態(tài)學(xué)變化判定造模是否成功。

        2.2 藥物干預(yù)方法

        判定造模成功后,模型制備成功大鼠按隨機(jī)數(shù)字表分為3組,分別是模型組、丹梔逍遙散組、達(dá)英-35組。模型組每天灌服等量蒸餾水,丹梔逍遙散組每天按時(shí)灌服丹梔逍遙散方,1次/d,給藥劑量換算法以成人女性平均體質(zhì)量60 kg體表面積換算,折合到大鼠用藥劑量為 9.2 g/(kg·d), 約為 1 mL/100 g,達(dá)英-35組每天灌服達(dá)英-35(每片含醋酸環(huán)丙孕酮2 mg和炔雌醇0.035 mg),臨床劑量為2.035 mg/d,折合到大鼠約為 0.2 mg/(kg·d),以蒸餾水溶解后,灌胃量按當(dāng)日大鼠體質(zhì)量灌服藥物,連續(xù)灌胃21 d,停藥7 d,28 d為1個(gè)療程,共給藥3個(gè)療程。

        2.3 標(biāo)本采集及組織形態(tài)學(xué)檢查

        頸椎脫臼法處死大鼠,摘取大鼠雙側(cè)卵巢,除去表層脂肪結(jié)締組織,用4%多聚甲醛固定,雙側(cè)卵巢作如下操作:一側(cè)HE染色后行形態(tài)學(xué)檢查,觀察卵巢形態(tài)學(xué)變化,另一側(cè)行免疫組化法檢測(cè)AMH蛋白表達(dá)情況。

        2.4 血清相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)

        大鼠灌胃完畢后所有大鼠禁食水12 h,斷頸取血后靜置離心,3 000 r/min離心20 min,收集上清液,-20℃冰箱儲(chǔ)存,按放免試劑盒說明書測(cè)定血清T及AMH。

        2.5 卵巢組織免疫組織化學(xué)分析

        按照SP檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行,工作濃度為1∶100,以細(xì)胞質(zhì)中有棕黃色或者棕褐色顆粒出現(xiàn)為陽性表達(dá)。切片置于400倍高倍鏡下觀察,每張切片隨機(jī)選擇觀察5個(gè)高倍鏡視野,采用Motic Images Plus 6.0計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析,以切片背景的灰度值作背底校正,測(cè)定平均光密度值(average optical density,AOD)。

        2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

        3 結(jié)果

        3.1 大鼠卵巢形態(tài)組織學(xué)

        空白對(duì)照組大鼠肉眼觀見卵巢色澤較紅潤,HE染色光鏡下可見空白對(duì)照組顆粒細(xì)胞排列整齊,形態(tài)完整,呈多層改變,可多達(dá)8~9層。模型組大鼠肉眼觀見卵巢表面蒼白,包膜增厚,隱約可見擴(kuò)張的囊泡,光鏡下可見囊狀擴(kuò)張卵泡,卵泡內(nèi)可見卵母細(xì)胞及放射冠消失,顆粒細(xì)胞層數(shù)減少,可為2~3層,且排列較為疏松,提示PCO大鼠模型造模成功。見圖1。

        圖1 大鼠卵巢組織光鏡圖(HE,×400)

        3.2 大鼠血清T、AMH水平表達(dá)的比較

        與空白對(duì)照組比較,模型組、丹梔逍遙散組、達(dá)英-35組T水平均顯著升高(P<0.01),模型對(duì)照組AMH水平升高(P<0.01),但丹梔逍遙散組、達(dá)英-35組與空白對(duì)照組比較AMH水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與模型對(duì)照組比較,丹梔逍遙散組、達(dá)英-35組T 及 AMH 水平下降(P<0.01 或 P<0.05)。 見表1。

        3.3 卵巢局部組織AMH表達(dá)比較

        與空白對(duì)照組比較,模型組、達(dá)英-35組AMH表達(dá)強(qiáng)度升高(P<0.01),但丹梔逍遙散組與其比較無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與模型對(duì)照組比較,丹梔逍遙散組、達(dá)英-35組AMH表達(dá)強(qiáng)度均下降(P<0.05)。見表1,圖2。

        表1 各組 T、AMH、AMH 蛋白表達(dá)的比較(±s)

        表1 各組 T、AMH、AMH 蛋白表達(dá)的比較(±s)

        注:與空白對(duì)照組比較,△P<0.01;與模型組比較,▲P<0.05,▲▲P<0.01。

        組別 n T(ng/mL) AMH(ng/mL) AMH吸光度值(OD)空白對(duì)照組 10 0.123±0.009 5.252±0.621 0.307±0.117模型組 10 0.172±0.006△ 6.078±0.325△ 0.498±0.105△丹梔逍遙組 10 0.132±0.004△▲▲5.046±0.552▲▲ 0.302±0.278▲達(dá)英-35組 10 0.144±0.006△▲▲5.628±0.420▲ 0.405±0.662△▲F值 101.248 8.479 13.342 P值 0.000 0.000 0.000

        圖2 各組大鼠卵巢局部AMH蛋白的表達(dá)(免疫組織化學(xué)法,×400)

        4 討論

        PCOS是高度異質(zhì)性內(nèi)分泌疾病和代謝紊亂疾病,高雄激素血癥與PCOS發(fā)病有相關(guān)性[6]。隨著國內(nèi)外學(xué)者對(duì)于PCOS病理機(jī)制研究越來越多,AMH與雄激素在HA患者卵巢局部微環(huán)境中的作用也日益受到關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn),PCOS患者的AMH水平高于正常同齡女性的2~3倍,且PCOS患者的AMH水平與睪酮水平具有相關(guān)性[7]。Xia等認(rèn)為AMH與雄激素二者之間的失調(diào)才是造成卵巢多囊化的主要原因[8]。其他報(bào)道[9]指出AMH在高雄激素的PCOS患者外周血中的表達(dá)量遠(yuǎn)高于雄激素水平正常但卵巢中有更多小卵泡的PCOS患者,說明AMH與卵泡數(shù)量并非簡單線性關(guān)系,可能是雄激素和 AMH對(duì)卵巢多囊化的改變起著協(xié)同作用。

        本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,模型對(duì)照組較空白對(duì)照組血清AMH水平及T水平明顯升高(P<0.01),且模型對(duì)照組AMH表達(dá)明顯高于空白對(duì)照組,這可能是睪酮水平的增高促進(jìn)了AMH的產(chǎn)生,而AMH的高表達(dá)抑制了芳香化酶的活性,阻礙其合成及雄激素向雌激素的轉(zhuǎn)化過程,造成局部卵巢高雄激素的微環(huán)境改變,引起HA。我們已知過多的雄激素可以提高始基卵泡向竇前和小竇卵泡發(fā)展速度,超過臨界,則可阻礙優(yōu)勢(shì)卵泡的選擇,而小竇卵泡中的顆粒細(xì)胞激素轉(zhuǎn)化并非朝著雌激素而是進(jìn)一步加重了局部高雄激素環(huán)境,周而復(fù)始使睪酮與AMH之間形成一個(gè)惡性通路,造成HA,并導(dǎo)致了卵巢多囊化。因此,我們認(rèn)為HA與卵巢局部微環(huán)境AMH及雄激素調(diào)節(jié)失常有關(guān)。

        在臨床上,PCOS高雄激素血癥患者往往表現(xiàn)為月經(jīng)失調(diào)、痤瘡、毛發(fā)濃密、脫發(fā)、肥胖等肝郁化熱癥狀。肝之不調(diào)影響到腎、脾、胃、心、肺等多臟腑的病變,導(dǎo)致痰、濕、熱(火)、瘀等多重病理因素交織,但肝氣郁結(jié)的病機(jī)貫穿HA發(fā)生發(fā)展的始終,為從肝論治HA提供了理論依據(jù)。袁迎軍等[10]用隨機(jī)數(shù)字表法將73例肝郁血熱型PCOS患者分為中藥組37例和西藥組36例,中藥組口服丹梔逍遙散加減,西藥組口服達(dá)因-35,3個(gè)月為1個(gè)療程,停藥1個(gè)月經(jīng)周期后兩組血清 LH、LH/FSH、T 均下降 (P<0.05),E2、FSH、PRL無明顯變化 (P>0.05)。停藥6個(gè)月經(jīng)周期后,中藥組血清LH、LH/FSH、T仍較治療前下降(P<0.05),西藥組恢復(fù)到治療前水平。丹梔逍遙散加減可有效治療肝郁血熱型PCOS,且遠(yuǎn)期療效肯定。本研究選用導(dǎo)師多年來運(yùn)用治療PCOS高雄激素血癥的基本處方——丹梔逍遙散。源于明朝薛己著《內(nèi)科摘要》,又名加味逍遙散,由山梔子、牡丹皮、當(dāng)歸、茯苓、白術(shù)、柴胡、牡丹皮、甘草等藥物組成。方中牡丹皮調(diào)肝瀉火,活血化瘀,梔子疏肝瀉火,內(nèi)清血熱,引火下行,當(dāng)歸、白芍益榮養(yǎng)血以養(yǎng)肝也。四藥合用清肝火瀉內(nèi)熱,白術(shù)、茯苓、甘草實(shí)脾土御肝木,益脾和中。獨(dú)柴胡一味,一以為厥陰之報(bào)使,一以升發(fā)諸陽。薄荷少許,疏散郁遏之氣,煨姜降逆和中。諸藥合用,正具有疏肝清熱、養(yǎng)血健脾之效,我們的研究結(jié)果顯示,與模型對(duì)照組比較,丹梔逍遙散組、達(dá)英-35組T水平均下降(P<0.01)。此外,還檢測(cè)了AMH水平及其蛋白表達(dá)強(qiáng)度,實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),與模型對(duì)照組比較,丹梔逍遙散組AMH水平、AMH表達(dá)強(qiáng)度均下降(P<0.01或P<0.05)。說明丹梔逍遙散在一定程度上也能夠降低AMH水平及AMH蛋白表達(dá)強(qiáng)度。根據(jù)Jonard和Dewailly[11]對(duì)AMH在PCOS中的作用機(jī)制提出的假說,認(rèn)為丹梔逍遙散治療HA可能是通過抑制高水平的AMH,降低AMH蛋白表達(dá),從而作用于顆粒細(xì)胞芳香化酶,促進(jìn)其合成,并增加卵泡對(duì)FSH敏感性,使得PCOS中卵巢AMH與FSH的平衡趨向中,由以AMH抑制芳香化酶作用為主的部分減弱,而增強(qiáng)FSH激活芳香化酶的作用,促使顆粒細(xì)胞將雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素,阻斷睪酮與AMH之間的惡性通路,調(diào)節(jié)二者改善卵巢局部微環(huán)境,從而改善HA。

        綜上所述,實(shí)驗(yàn)提示丹梔逍遙散能夠降低AMH及T水平,降低顆粒細(xì)胞AMH蛋白表達(dá)改善高雄激素狀態(tài),達(dá)到治療HA的目的。中藥治療HA是多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)的協(xié)同過程,丹梔逍遙散是否通過其他途徑影響AMH從而改善HA尚不得知。因此,進(jìn)一步以卵巢局部AMH為切入點(diǎn)深入研究中醫(yī)藥干預(yù)HA卵巢局部微環(huán)境的調(diào)控機(jī)制,可為我們探索中藥干預(yù)PCOS高雄激素血癥疑難病癥方法研究提供理論依據(jù)和新的思路。

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        (本文編輯 楊 瑛)

        Effects of Danzhi Xiaoyao Powder on the Expression of Serum T,AMH and Local Ovaries AMH in Polycystic Ovaries Rats

        HOU Liying1,DENG Liling1,LUO Pei1,YU Ximing1,QUAN Chunmei1,ZHAO Na1,YANG Zhengwang2*
        (1.Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China;2.Department of Gynecology and Obestrics,the First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410007,China)

        ObejectiveTo investigate the effect of Danzhi Xiaoyao powder on the experssion of serum testosterone(T),anti-mulerian hormone (AMH)and local ovarian AMH in polycystic ovaries (PCO)rats.MethodsThe PCO rat models were built by subcutaneous injection of dehydroepiandrostexone at back of SD female rats. The succesfully modeling rats were randomly devided into normal group,Diane-35 group,Danzhi Xiaoyao powder group and the blank group was also assigned.The rats were given intragastric gavage with distilled water,Diane-35 and Danzhi Xiaoyao powder,respectively,continuously for 21 days,stopped for 7 days as a cycle.After 3 cycles of administration,the rats were executed.The serum level of T and AMH were measured with radioimmunoassy.The local ovarian expression of AMH were measured with immunohistomchemical.ResultsCompared with the model group,the serum of T,AMH and the expression of AMH in the Danzhi Xiaoyao Powder group were reduced (P<0.01 or P<0.05).ConclusionDanzhi Xiaoyao powder could treat hyperandrogenism (HA)by lowering the serum T,AMH and the local ovarian AMH expression,so it can improve HA with benign regualtion on AMH.

        polycystic ovary syndrome;hyperandrogenism;anti-mulerian hormone;Danzhi Xiaoyao powder;cortex moutan radicis;fructus gardeniae

        R285.5;R289.53;R711.75

        A

        10.3969/j.issn.1674-070X.2017.02.007

        2016-07-02

        湖南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(14JJ7061)。

        侯麗瑩,女,在讀碩士研究生,研究方向:生殖內(nèi)分泌。

        *楊正望,女,博士,主任醫(yī)師,碩士研究生導(dǎo)師,E-mail:435068288@qq.com。

        本文引用:侯麗瑩,鄧麗玲,羅 佩,余曦明,全春梅,趙 娜,楊正望.丹梔逍遙散對(duì)多囊卵巢大鼠血清T、AMH及卵巢局部AMH蛋白表達(dá)的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2017,37(2):141-144.

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