劉慧，簡(jiǎn)潔雯

信陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院檢驗(yàn)學(xué)院

關(guān)于CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的研究進(jìn)展及應(yīng)用前景

劉慧，簡(jiǎn)潔雯

信陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院檢驗(yàn)學(xué)院

1 、研究目的

所謂的基因編輯技術(shù)指的就是研究人員為了使得特定的某種目的能夠被達(dá)成，而去修飾動(dòng)物的遺傳組成的過程，這以技術(shù)綜合性以及挑戰(zhàn)性相對(duì)較強(qiáng)，其對(duì)于整個(gè)基因遺傳學(xué)的發(fā)展有著極為重要的意義?；蚓庉嫾夹g(shù)的應(yīng)用能夠使得相關(guān)人員精確的對(duì)DNA進(jìn)行添加、刪除、置換操作，進(jìn)而使得基因能夠依照人們意愿所呈現(xiàn)。CRISPR/Cas9系統(tǒng)是通過對(duì)一種RNA的調(diào)控來達(dá)到DNA修飾的目的的基因編輯工具，其本質(zhì)為叫鋅指核酸酶和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶，和其他基因編輯工具相比，此種基因編輯工具打靶在標(biāo)準(zhǔn)型以及高效性上所具有的優(yōu)勢(shì)性更加明顯，并且其在設(shè)計(jì)上更加容易操作，所具有的特異性也更加突出。

2 、研究現(xiàn)狀

CRISPR/Cas9的興起時(shí)間是1987年，研究人員以日本科研人員為主，其在大腸桿菌的基因組中發(fā)現(xiàn)了以相互間隔狀態(tài)所存在的短文序列，這些短文序列的存在可以在一定程度上給予細(xì)菌和古細(xì)菌免疫性，基于這一點(diǎn)當(dāng)時(shí)就有研究人員提出CRISPR/Cas9可能會(huì)在DNA修復(fù)系統(tǒng)中起到作用。CRISPR/Cas9主要存在于原核生物中，絕大多數(shù)的古細(xì)菌以及細(xì)菌都會(huì)具備此種蛋白免疫系統(tǒng)，這為CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的進(jìn)一步研究創(chuàng)造了條件，在最開始的時(shí)候CRISPR/Cas9系統(tǒng)并不能夠直接應(yīng)用到人或動(dòng)物上，只有通過一定的改造手段對(duì)其進(jìn)行改造才能夠使其成為把核酸酶作為核心的基因編輯技術(shù)并加以應(yīng)用。在2002年，相關(guān)研究人員以原核生物為對(duì)象進(jìn)行了生物信息學(xué)的分析，分析結(jié)果表明短文序列主要存在的品種為原核生物，這和上文的研究結(jié)果是能夠達(dá)成一致的，此外研究人員也指出重復(fù)序列在不同原核生物的長(zhǎng)度是有一定差別的，一般長(zhǎng)度為21bp到37bp之間，并且其在存在過程中也會(huì)被某些非重復(fù)序列所隔開，在這個(gè)時(shí)期研究人員才把該基因家族定義為CRISPR（Jansen etal.2002）。此外在此研究中也對(duì)CRISPR的位點(diǎn)進(jìn)行了分析，分析表明CRISPR位點(diǎn)側(cè)翼區(qū)是一個(gè)先導(dǎo)序列，先導(dǎo)序列的長(zhǎng)度為300到500bp之間。前導(dǎo)序列和重復(fù)序列之間存在一定的聯(lián)系，一般情況下同一個(gè)物種中兩者之間的保守程度相對(duì)較大，不同物種中所呈現(xiàn)的變異性則相對(duì)較為突出。同時(shí)每個(gè)物種中存在不同CRISPR位點(diǎn)的可能性也是非常大的。（Jansen et al.2002）。

在2005年，著名學(xué)者Pourcel C為了對(duì)CRISPR/Cas9間隔序列進(jìn)行進(jìn)一步的研究與探討，以三種鼠疫桿菌為對(duì)象對(duì)CIRPSR位點(diǎn)進(jìn)行了測(cè)序處理，測(cè)序完成后其發(fā)現(xiàn)了29個(gè)新的間隔序列，這些間隔序列存在一定的差異性。此外其還對(duì)9株鼠疫桿菌株進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，在9株鼠疫桿菌株中，發(fā)現(xiàn)的間隔序列達(dá)到了132個(gè)，所發(fā)現(xiàn)的這些間隔序列在擺脫那個(gè)菌株中以相同狀態(tài)所存在的數(shù)量只有三個(gè)，其他的序列都以不同狀態(tài)所存在（Pourcel et al.2005）。研究學(xué)者M(jìn)ojica等在2005年通過實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)了CRISPR間隔序列和外源質(zhì)粒的同源性是非常高的，當(dāng)噬菌體或者外源質(zhì)粒受到細(xì)菌的再次感染時(shí)，間隔序列的細(xì)菌可以起到組織噬菌體以及外源致粒再次入侵的作用。（Mojica et al.2005）。著名學(xué)者Bolotin為了對(duì)間隔序列進(jìn)行進(jìn)一步的了解而進(jìn)行了噬菌體敏感性實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明間隔序列的主要來源為外部的噬菌體以及基因組，進(jìn)而可以得出原核生物的CRISPR位點(diǎn)本質(zhì)上其實(shí)就是外援病毒以及噬菌體在對(duì)細(xì)菌入侵過程中所留下的痕跡，其和細(xì)菌的免疫機(jī)制有著一定的聯(lián)系。Bolotin et al.2005；Barrangou et al.2007）。

Cas蛋白是CRISPR/Cas系統(tǒng)的重要組合部分之一，其在整個(gè)CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)作用發(fā)揮過程扮演著極為重要的角色。在2005年，Haft等研究學(xué)者就通過對(duì)生物信息學(xué)的應(yīng)用發(fā)現(xiàn)了45種Cas蛋白，其中和DNA修復(fù)有著密切關(guān)系的的Cas蛋白種類為Csm3-5,Cmrl,Cmr3,Cmr4,Cmr6和Csx7蛋白（Haft et al.2005）。在所有的Cas蛋白中，存在于古細(xì)菌以及絕大部分細(xì)菌中的是Casl-6，其他種類的Cas蛋白則具備一定的種屬特異性（Ternsand Terns 2011）。Cas1和Cas2蛋白在細(xì)菌免疫處于干擾階段時(shí)并不會(huì)發(fā)揮出作用，但是在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)這兩種蛋白都具有一定的核算內(nèi)切酶的火星，因此其在間隔序列中起到的作用也是非常重要的。

3 、CRISPR/Cas9技術(shù)的在動(dòng)物基因組編輯研究中的應(yīng)用

基因編輯動(dòng)物的獲得是科學(xué)領(lǐng)域研究基因技術(shù)的一個(gè)突破，由于CRISPR/Cas9系統(tǒng)所具有的高效、簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)，在其得到研究開發(fā)后被廣泛應(yīng)用到生物遺傳改造中。在2013年，Cong等通過對(duì)源于釀弄鏈球菌CRISPR/Cas9系統(tǒng)的構(gòu)建實(shí)現(xiàn)了對(duì)人體293FT細(xì)胞EMX1、PVALB位點(diǎn)的切割（Cong et al.2013）。

同年，Mali等則以內(nèi)源性的AAVSI基因?yàn)閷?duì)象，通過CRISPR/ Cas9技術(shù)的應(yīng)用使得293T細(xì)胞、K562細(xì)胞以及IPS細(xì)胞得到一定程度的敲除（Mali et al.2013b）。

T細(xì)胞在人體血液循環(huán)過程以及免疫過程中扮演著極為重要的角色，其是未來醫(yī)藥技術(shù)開發(fā)過程中重點(diǎn)開發(fā)的靶點(diǎn)細(xì)胞之一，T細(xì)胞基因組的研究與開發(fā)會(huì)在一定能夠程度上為癌癥、艾滋病等免疫性疾病的研究提供更多的可能性。在2013年，Ebina等研究人員通過靶向HIV-1 LTR的CRISPR/Cas9系統(tǒng)的利用使得HIV-1的LTR得到啟動(dòng)并表達(dá)，并誘發(fā)了T細(xì)胞的產(chǎn)生。

[1]李響,董波.CRISPR/Cas9技術(shù)及其在海洋生物中的應(yīng)用現(xiàn)狀與展望[J].水生生物學(xué)報(bào),2017,41（1）:244-256.

[2]任文琳,張俊,徐桂霞,等.CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)及其在RNA編輯中的潛在應(yīng)用[J].生物技術(shù)進(jìn)展,2017（1）:1-6.