李昆華 楊丹 蘇娟 李鋒 岳健

摘要 [目的]開展鐵皮石斛根系促生內(nèi)生真菌的篩選，為鐵皮石斛的批量化生產(chǎn)提供生物防治基礎(chǔ)。[方法]采用組織分離法對鐵皮石斛根系內(nèi)生真菌進行分離純化，再通過單一回接試驗將已分離內(nèi)生真菌回接到鐵皮石斛組培苗中，40 d后觀察鐵皮石斛根系生長情況，60 d后統(tǒng)計成活率。通過鐵皮石斛根系生長指標(biāo)，篩選出對根系促生作用最顯著的內(nèi)生真菌。[結(jié)果]從鐵皮石斛根系中共分離得到21株內(nèi)生真菌，篩選出8株優(yōu)勢促生根系內(nèi)生真菌，其中回接菌株F5的鐵皮石斛組培苗生根率最高，達(dá)99.00%，回接菌株F14的鐵皮石斛苗成活率達(dá)100.00%，為對照組的395%。[結(jié)論]該研究成功解決了鐵皮石斛移栽成活率低的難題。

關(guān)鍵詞 鐵皮石斛；內(nèi)生真菌；篩選；根系生長；成活率

中圖分類號 S567.23+9 文獻標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）01-0128-02

Selection of Growth Promoting Endophytic Fungi for Dendrobium candidum

LI Kunhua， YANG Dan， SU Juan， YUE Jian* et al

（Yunnan Shanlihong Biological Technology Co.， Ltd.， Kunming， Yunnan 650206）

Abstract [Objective] The aim was to screen out growth promoting endophytic fungi for Dendrobium candidum， to provide the basis for biological control of batch production of Dendrobium candidum. [Method] Endophytic fungi were isolated and purified from Dendrobium candidum roots by tissue isolation method. Through single inoculation experiment， the isolated endophytic fungi were inoculated to tissue culture seedlings. After 40 d， roots growth was observed， the survival rate was calculated after 60 d. By observing root growth index， endophytic fungi with most significant growth promoting effect were screened out. [Result] 21 strains of endophytic fungi were isolated from Dendrobium candidum roots， among which， 8 dominant endophytic fungi were screened out. The rooting rate of tissue culture seedling of strain F5 was the highest， reaching 9900%， the survival rate of F14 was up to 100.00%， which is 395% of the control group. [Conclusion] The low survival rate of transplanting of Dendrobium candidum was successfully solved.

Key words Dendrobium candidum；Endophytic fungi；Screening；Root growth；Survival rate

鐵皮石斛（Dendrobium candidum）是蘭科石斛屬多年生附生植物，在醫(yī)藥領(lǐng)域的研究與開發(fā)方面應(yīng)用廣泛，具有潤肺清熱、滋陰養(yǎng)胃、清肝明目、抵抗癌癥、降低血糖等藥用價值[1-5]，集中分布于福建、浙江、安徽、廣西、云南等地[6-7]。

但由于鐵皮石斛的自然繁殖率低，對環(huán)境條件要求較嚴(yán)格，產(chǎn)區(qū)藥農(nóng)長期采挖等因素導(dǎo)致自然資源已瀕臨滅絕。而鐵皮石斛又因為種子微小，沒有胚乳，因此自然條件下不利于獲得大批量鐵皮石斛幼苗[8]。當(dāng)前，石斛組織培養(yǎng)體系已成功建立，可大量繁殖石斛無性苗，但無性苗移栽成活率低、生長緩慢、生長周期長等問題，成為石斛無性苗人工栽培瓶頸[9-10]。

內(nèi)生真菌的研究及應(yīng)用可成為解決這一難題的突破口[11-12]。植物內(nèi)生真菌能夠增強寄主植物抗病性、抗逆性等[13-15]。目前，國內(nèi)外關(guān)于鐵皮石斛內(nèi)生真菌的研究主要集中在鐵皮石斛葉片內(nèi)生真菌種屬地位[16]、內(nèi)生真菌的形成特點和共生機制、內(nèi)生真菌對鐵皮石斛組培苗的促生作用[17-18]、內(nèi)生真菌的分離和鑒定方法方面[19-20]。應(yīng)用方面研究僅停留在內(nèi)生真菌與鐵皮石斛組培苗的共生培養(yǎng)階段，而制約著鐵皮石斛規(guī)?；a(chǎn)的關(guān)鍵階段——移栽階段的內(nèi)生真菌應(yīng)用領(lǐng)域的研究尚屬空白。該研究通過對鐵皮石斛組培苗接種不同真菌菌株， 篩選出能與鐵皮石斛建立共生關(guān)系并能明顯增加其移栽成活率的優(yōu)良內(nèi)生真菌，為鐵皮石斛的工廠化繁殖提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試鐵皮石斛根系采自于云南文山州廣南縣境內(nèi)的野生鐵皮石斛，將根樣連同根際土壤裝入牛皮紙袋中，帶回實驗室冷藏備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 內(nèi)生真菌的分離。

將野生鐵皮石斛的根樣用流水沖洗干凈，用無菌水浸泡1 h，切成1 cm左右小段，用75%酒精消毒5 s，置于無菌水中浸泡1 min，再用0.1%升汞消毒1 min，無菌水沖洗6次，用已滅菌濾紙吸干根段水分，接種于PDA培養(yǎng)基內(nèi)，每個培養(yǎng)基放置4個根段。并設(shè)置空白對照試驗，即將已滅菌根樣置于PDA培養(yǎng)基中滾動數(shù)次，若無菌落長出，則證明根段表面消毒合格。置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待菌絲從根組織上長出后，挑出尖端菌絲轉(zhuǎn)移到另一PDA平板上純化培養(yǎng)。然后轉(zhuǎn)入PDA斜面培養(yǎng)基，最后將得到純化培養(yǎng)的菌株接種到試管中，置于4 ℃冰箱保存。

1.2.2 內(nèi)生真菌與鐵皮石斛的共生培養(yǎng)。

將鐵皮石斛組培苗轉(zhuǎn)接至50%MS培養(yǎng)基+0.75%蔗糖+0.80%瓊脂培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)。10 d后，每處理選取10瓶無污染的苗， 用打孔器（直徑0.5 cm）打取在PDA平板培養(yǎng)基上活化的菌株瓊脂塊， 每瓶接入一個染菌的瓊脂小塊， 置于瓶子中心， 使染菌瓊脂塊離幼苗的距離相同，另取10瓶無污染苗在相同位置接入同等量的無菌瓊脂塊作為對照，3次重復(fù)。所有接菌處理苗和對照苗均置于溫度25 ℃、濕度75%～80%、光照強度1 000～1 500 lx、光照時間10 h/d的組培室內(nèi)培養(yǎng)，共同培養(yǎng)40 d后觀察鐵皮石斛和菌株的生長狀況并統(tǒng)計生根率、平均根長和平均生根數(shù)。

1.2.3 煉苗與移栽。

將組培苗和共生真菌一起移入溫室大棚閉瓶煉苗7 d，再開瓶煉苗2 d，最后移栽到甘蔗渣+樹皮的基質(zhì)中（基質(zhì)提前用多菌靈800倍液消毒），澆透水，覆蓋薄膜，雙層遮陰。60 d后統(tǒng)計成活率。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生真菌的分離

采集并截取鐵皮石斛根段152個，在其中74段里分離出內(nèi)生真菌，通過純化培養(yǎng)和初步形態(tài)特征歸類，得到21株內(nèi)生真菌，編號為F1～F21。

2.2 內(nèi)生真菌與鐵皮石斛的共生培養(yǎng)

鐵皮石斛與內(nèi)生真菌共培養(yǎng)14 d后，其中9個處理菌株（F1、F2、F6、F7、F11、F16、F19、F20、F21）生長旺盛，而鐵皮石斛幼苗則生長緩慢、葉片發(fā)黃。共培養(yǎng)40 d后，上述9個處理中的幼苗全部死亡； 將剩下12組處理中的幼苗根部做切片用顯微鏡進行觀察，發(fā)現(xiàn)其中8組菌株成功侵入鐵皮石斛幼苗根部，形成共生關(guān)系，且其生根率、根長及根數(shù)均明顯高于對照組，幼苗葉片深綠，生長健壯，其中接入編號為F5的鐵皮石斛組培苗生根率最高，達(dá)99.00%，在根的整齊度和生根數(shù)量上也優(yōu)于其他組合；其他4組并未觀察到菌絲侵染，幼苗生根率、根長及根數(shù)與對照組無明顯差異，幼苗纖弱，偶有葉片發(fā)黃現(xiàn)象（表1）。

2.3 煉苗與移栽

在鐵皮石斛與內(nèi)生真菌共培養(yǎng)60 d后，將鐵皮石斛菌根化幼苗移栽到溫室大棚。移栽后15 d內(nèi)，部分幼苗相繼出現(xiàn)死亡，20 d后不再發(fā)現(xiàn)死亡幼苗，60 d后統(tǒng)計成活率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌株F3、F5、F8、F9、F13、F14、F15、F18、CK的成活率分別為80.67%、90.00%、76.67%、90.67%、9267%、100.00%、78.67%、68.00%、25.32%，可見接入菌株F14的鐵皮石斛苗全部成活，幼苗健壯，成活率為對照組的395%，對照組幼苗不僅成活率低，且存活幼苗纖弱發(fā)黃，其他7組的成活率較之對照組也達(dá)269%～366%，菌根化苗成活率遠(yuǎn)高于非菌根化苗，可見篩選出的內(nèi)生真菌與鐵皮石斛組培苗共培養(yǎng)后能大幅提高移栽成活率。

3 結(jié)論與討論

該研究對從鐵皮石斛根系中共分離得到的21株內(nèi)生真菌，通過單一回接試驗，分析鐵皮石斛根系生長指標(biāo)，最終篩選出促進鐵皮石斛組培苗根系生長的內(nèi)生真菌8株，最優(yōu)促鐵皮石斛移栽成活率的是菌株F14。

在共生培養(yǎng)時，有9個處理中的內(nèi)生真菌接入后生長尤為旺盛，初期表現(xiàn)為幼苗不生長，到了后期，這9組接菌苗全部死亡，導(dǎo)致幼苗死亡的原因尚不明確，可能這9種真菌是導(dǎo)致幼苗死亡的直接原因，也可能這9種真菌本身不對幼苗產(chǎn)生致死影響甚至可能促進幼苗生長，但由于接入對其生長有利的培養(yǎng)基導(dǎo)致其過分旺盛生長，從而抑制了鐵皮石斛幼苗的生長，最終使幼苗全部死亡。其他12個處理中的真菌生長雖不過分旺盛，但菌絲生長量也參差不齊。因此，在篩選鐵皮石斛內(nèi)生真菌的同時，對共生培養(yǎng)基進行篩選也十分必要。

編號為F5的內(nèi)生真菌在生根培養(yǎng)中具有最佳促生根效果，在移栽后，接入F5的菌根化苗成活率僅達(dá)90.00%，而接入F14的菌根化苗移栽成活率達(dá)100.00%，可見在鐵皮石斛的不同生長階段，可能需要與不同的內(nèi)生真菌共生。這與郭順星等[21]的研究結(jié)果一致。

目前關(guān)于鐵皮石斛的組培快繁技術(shù)方面的研究十分成熟，已建立了較為完整的鐵皮石斛組培快繁體系，該試驗在借鑒前人研究成果的基礎(chǔ)上，不斷探索更好的生根培養(yǎng)基配方，使鐵皮石斛組培苗生根率達(dá)到了較高水平，然而生根率和移栽成活率并不對等，該研究篩選出的8株內(nèi)生真菌對鐵皮石斛組培苗生根有一定的正向作用，同時解決了組培苗移栽成活率低的問題，在鐵皮石斛工廠化育苗中有良好的應(yīng)用前景。

對該研究中篩選出的最優(yōu)促鐵皮石斛根系生長及組培苗移栽成活率的一株內(nèi)生真菌F14，未進行種屬地位的鑒定。下一步應(yīng)通過菌落形態(tài)及顯微結(jié)構(gòu)觀察，并結(jié)合ITS序列PCR擴增技術(shù)，確定促生作用最顯著的菌株F14的種屬地位。

參考文獻

[1]

朱艷，秦民堅.鐵皮石斛莖段誘導(dǎo)叢生芽的研究[J].中國野生植物資源，2003，22（2）：56-57.

[2] 李滿飛，徐國鈞，徐璐珊，等.商品石斛的調(diào)查及鑒定（Ⅱ）[J].中草藥，1991，22（4）：173-176，180.

[3] 丁鴿，丁小余，沈潔，等.鐵皮石斛野生居群遺傳多樣性的RAPD分析與鑒定[J].藥學(xué)學(xué)報，2005，40（11）：1028-1032.

[4] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010：265-266.

[5] 吳昊姝，徐建華，陳立鉆，等.鐵皮石斛降血糖作用及其機制的研究[J].中國中藥雜志，2004，29（2）：160-163.

[6] 中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會.中國植物志：第19卷[M].北京：科學(xué)出版社，1999.

[7] 柳蓮芳.鐵皮石斛的最新研究進展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（11）：6426-6428.

[8] 黃勇.鐵皮石斛組織培養(yǎng)技術(shù)研究進展[J].文山學(xué)院學(xué)報，2013，26（6）：14-19.

[9] 金輝，亢志華，陳暉，等.菌根真菌對鐵皮石斛生長和礦質(zhì)元素的影響[J].福建林學(xué)院學(xué)報， 2007，27（1）：80-83.

[10] 趙昕梅，遠(yuǎn)凌威，張?zhí)K鋒，等.鐵皮石斛內(nèi)生真菌的分離鑒定及其促宿主生長作用[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，41（6）：101-105.

[11] 金輝，許忠祥，陳金花，等.鐵皮石斛組培苗與菌根真菌共培養(yǎng)過程中的相互作用[J].植物生態(tài)學(xué)報，2009，33（3）：433-441.

[12] 陳曉梅，郭順星，孟志霞.真菌誘導(dǎo)子對鐵皮石斛原球莖生長的影響[J].中草藥，2008，39（3）：423-426.

[13] 何勁，雷幫星，宋貞富，等.石斛內(nèi)生細(xì)菌DEB-2對5種辣椒病原真菌的抑制作用[J].植物保護學(xué)報，2014，41（2）：157-162.

[14] 楊紹周，吳毅歆，邵德林，等.鼓槌石斛內(nèi)生細(xì)菌分離、鑒定及功能分析[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2014，30（25）：171-176.

[15] 徐文婷，張雅瓊，董文漢，等.石斛內(nèi)生真菌固體菌劑對鐵皮石斛組培苗促生作用研究[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報，2014，27（1）：317-324.

[16] 陳澤斌，李冰，王定康，等.鐵皮石斛葉片內(nèi)生真菌多樣性的研究[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報，2015，30（10）：978-983.

[17] 徐文婷，張雅瓊，董文漢，等.石斛內(nèi)生真菌固體菌劑對鐵皮石斛組培苗促生作用研究[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報，2014，27（1）：317-324.

[18] 毛益婷，代曉宇，馬榮.不同生境下野生鐵皮石斛內(nèi)生真菌多樣性的初步研究[J].新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2011，34（3）：234-238.

[19] 陳玉棟，李文錦，雷玲，等.鐵皮石斛內(nèi)生真菌的分離與鑒定[J].信陽師范學(xué)院學(xué)報（自然科學(xué)版），2009，22（2）：236-238.

[20] 侯曉強，郭順星.鐵皮石斛促生長內(nèi)生真菌的篩選與鑒定[J].中國中藥雜志， 2014， 39（17）：3232-3237.

[21] 郭順星，曹文芩，高微微.鐵皮石斛及金釵石斛菌根真菌的分離及其生物活性測定[J].中國中藥雜志， 2000， 25（6）：338-341.