李紅　楊曉歌　李霄

摘要 [目的] 優(yōu)化漏蘆花總黃酮提取工藝和純化工藝，為漏蘆花抗炎藥效部位的開發(fā)奠定基礎。 [方法] 以總黃酮為指標，采用UV測定方法，在檢測波長413 nm下，測定總黃酮含量，確定純化漏蘆花總黃酮純化大孔樹脂型號；并采用正交試驗分別考察乙醇濃度、回流次數(shù)、回流時間和乙醇用量對漏蘆花總黃酮提取工藝的影響及乙醇體積分數(shù)、上樣液質(zhì)量濃度、pH和上樣液流速對總黃酮純化工藝的影響。 [結果] 確定漏蘆花總黃酮提取工藝的最優(yōu)方案為采用75%乙醇溶液，回流2次，每次回流時間45 min，乙醇用量12倍，影響因素的順序從大到小依次為乙醇濃度、回流時間、乙醇用量、回流次數(shù)。純化工藝試驗中，最優(yōu)純化工藝條件為上樣液濃度0.05 g/mL，上樣液pH為5，上樣液流速為3 mL/min，徑高比為1 ∶9，最佳上樣量為藥材量與樹脂用量比2 ∶1，乙醇體積分數(shù)50%，洗脫液用量5 BV；純化后干膏里漏蘆花抗炎有效部位總黃酮含量為42.3%。 [結論] AB- 8型大孔樹脂可有效富集、純化漏蘆花總黃酮，優(yōu)選的提取和純化工藝穩(wěn)定可行。

關鍵詞 漏蘆花；提?。患兓?；大孔樹脂；總黃酮

中圖分類號 S567；R284.2 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）01-0124-04

Extraction and Purification Process of Total Flavonoids from Rhaponticum uniflorum （L.）DC.

LI Hong， YANG Xiaoge， LI Xiao*

（Beijing University of Technology， Beijing 100124）

Abstract [Objective] To optimize extraction and purification process of total flavonoids from Rhaponticum uniflorum， to lay a foundation for development of antiinflammatory parts of Rhaponticum uniflorum. [Method] UV was employed to determine the content of total flavonoids with detection wavelength at 413 nm；using orthogonal design to investigate effects of ethanol concentration， reflux times， reflux time and alcohol dosage on extraction of total flavonoids from Rhaponticum uniflorum， as well as effects of ethanol volume fraction， mass concentration of sample solution， pH and sample liquid flow rate on purification of total flavonoids. [Result] As for extraction process， the optimum scheme was： 12 times extraction solvent dosage， 75% ethanol reflux， extraction for 2 times， each time for 45 minutes. The order of influencing factors was ethanol concentration， reflux time， ethanol dosage and reflux times. As for purification process， optimum technological conditions were as follows： ratio of diameterheight 1 ∶9， sample solution concentration of 0.05 g/mL， sample solution flow rate of 3 mL/min， pH 5.0， with 5 BV of 75% ethanol as eluent；total flavonoids was 42.3% in antiinflammatory parts of Rhaponticum uniflorum after purification. [Conclusion] Total flavonoids from Rhaponticums dried flowers could be effectively purified and enriched by AB8 macroporous resin.

Key words Rhaponticum uniflorum；Extraction；Purification；Macroporous resin；Total flavonoids

漏蘆花為菊科植物祁州漏蘆（Rhaponticum uniflorum（L.）DC）的干燥花，蒙藥名字是洪古日朱勒，具有殺“粘”、止刺痛、清熱解毒、解表等功能，一般用于腸刺痛、瘟熱發(fā)癥、結喉麻疹、毒熱心熱等[1-2]。漏蘆花在蒙醫(yī)臨床中有較長的使用歷史[3]，研究表明，漏蘆花中含有黃酮、揮發(fā)油、植物甾醇、萜類等多種活性成分[4-9]，其中黃酮類具有明顯的抗炎作用[10]和耐缺氧作用[11]。該試驗以總黃酮含量為評價指標，優(yōu)化漏蘆花總黃酮的提取工藝參數(shù)和純化工藝參數(shù)，以期為漏蘆花抗炎有效部位的利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 儀器

UV-2550紫外分光光度儀（日本島津公司）；Millipore MilliQ 超純水制備儀（LABCONCO公司）；METTLER AG 285型電子天平（1/10萬，瑞士梅特勒公司）；KD-300DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市儀器有限公司）；SHB-III型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；R1002-VN型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；SHSL調(diào)溫電熱套（上海樹立儀器儀表有限公司）；容量瓶；樹脂柱；D4020、AB-8、X-5、S-8、NKA-9、H103等型號大孔吸附樹脂均購自南開大學化工廠。

1.2 試藥

槲皮素（自制）；祁州漏蘆花（河北康派中藥材有限公司，批號101106）。無水乙醇（北京化工廠，分析純）；三氯化鋁（北京化工廠，分析純）；無水醋酸鈉（國藥集團化學試劑有限公司，分析純）；醋酸（北京化工廠，分析純）；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.3 方法

1.3.1 漏蘆花總黃酮提取工藝優(yōu)化。

1.3.1.1

對照品溶液的制備。精密稱取槲皮素12 mg，60%乙醇溶解并定容于100 mL容量瓶，得0.120 mg/mL對照品溶液。

1.3.1.2

供試品溶液的制備。精密稱取2 g漏蘆花粉末，加入75%乙醇溶液80 mL于圓底燒瓶中，稱重，回流40 min，冷卻至室溫，再稱重，75%乙醇補足重量，混勻，過濾，吸取續(xù)濾液2 mL于25 mL容量瓶中，定容。

1.3.1.3

顯色方法與檢測波長的選擇。總黃酮類成分含量測定的顯色方法主要有NaNO2-Al（ NO3）2-NaOH顯色法、AlCl3-NaAc法和三乙胺法。分別參考文獻[12-14]進行漏蘆花總黃酮含量測定，并進行比較。

1.3.1.4

標準曲線的繪制。精密吸取對照品溶液1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL置于25 mL容量瓶中，分別加入1.5%氯化鋁溶液8 mL和pH 5.4的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液4 mL，搖勻后加入60%乙醇溶液定容至刻度，搖勻，在常溫下靜置40 min，于413 nm處測定其吸光度值。以吸光度A為縱坐標、槲皮素濃度C（μg/mL）為橫坐標繪制標準曲線。

1.3.1.5

精密度試驗。精密吸取0.12 mg/mL對照品溶液1 mL于25 mL容量瓶中，按照“ 1.3.1.4 ”操作，測定吸光度，重復試驗6次。記錄吸光度和RSD。

1.3.1.6 穩(wěn)定性試驗。精密吸取漏蘆花供試品溶液1.0 mL于25 mL容量瓶中，按照“ 1.3.1.4 ”操作，分別于0、1、2、4、6、18、24 h測定樣品中總黃酮含量并記錄數(shù)據(jù)，計算RSD。

1.3.1.7

重復性試驗。精密稱取同一批次的漏蘆花粉末，共6份，每份2 g，按照“ 1.3.1.2 ”制備供試品溶液，按照“ 1.3.1.4 ”操作，測定吸光度和RSD。

1.3.1.8 加樣回收率。精密稱取已知含量的漏蘆花樣品2 g，共6份，分別加入含槲皮素標品11.44 mg的標準溶液后，按照“ 1.3.1.2 ”制備供試品溶液，然后按照“ 1.3.1.4 ”方法測定吸光度，重復平行試驗6次。計算回收率和RSD。

1.3.1.9

提取工藝正交試驗。根據(jù)漏蘆花中黃酮類化合物的理化性質(zhì)，并結合實際生產(chǎn)需要，采用L9（34）不重復正交試驗，確定考察提取因素為乙醇濃度、回流次數(shù)、回流時間、乙醇用量（倍量）。正交因素水平表見表1。取蒙藥漏蘆花粉末18份（分為9組，每組2份），每份5 g，精密稱定，按表1進行試驗?；亓骱鬄V液減壓回收至100 mL，分別吸取1 mL于25 mL容量瓶中，按照“ 1.3.1.4 ”方法測定吸光度，計算總黃酮含量。

1.3.2 漏蘆花總黃酮純化工藝。

1.3.2.1

樣品溶液的制備。稱取漏蘆花粉末200 g，按照優(yōu)化的漏蘆花有效部位提取工藝，收集并合并濾液，得漏蘆花藥液（總黃酮含量為4624.10 μg/mL）。

1.3.2.2 樹脂的篩選。

（1）靜態(tài)吸附性能比較。根據(jù)漏蘆花總黃酮的理化性質(zhì)和樹脂吸附性能，選擇D4020、H103、NKA-9、S-8、X-5和AB-8型大孔樹脂進行靜態(tài)吸附試驗。取5種預處理好的樹脂各5 g，分別置于50 mL具塞磨口錐形瓶中，各加入按提取最優(yōu)工藝提取的漏蘆花藥液（1 g/mL）10 mL，于室溫下攪拌放置8 h至吸附平衡，過濾，按氯化鋁法測定濾液中總黃酮含量，計算吸附率。

（2）靜態(tài)洗脫性能比較。將上述試驗過程中已吸附漏蘆花總黃酮的樹脂過濾晾干，分別置于50 mL具塞磨口錐形瓶中，加入70%乙醇30 mL，于室溫下攪拌洗脫8 h，過濾，按氯化鋁法測定濾液中總黃酮含量，計算洗脫率。

1.3.2.3

泄漏曲線的繪制。取AB-8型大孔樹脂約10 g，裝入15 mm × 200 mm的樹脂柱中，另取漏蘆花樣品溶液適量，加水稀釋為0.2 g/mL，上樹脂柱，上樣流速為1.0 mL/min。每份10 mL，共收集14份，取適量溶液，按照“ 1.3.1.4 ”操作，測定吸光度，換算出相應的總黃酮含量。以漏蘆花黃酮泄漏量（μg）為縱坐標、上樣液體積為橫坐標繪制泄露曲線。

1.3.2.4

洗脫劑濃度試驗。取AB-8型大孔樹脂10 g，分別裝入4根15 mm×200 mm相同規(guī)格的樹脂柱，按1 ∶9徑高比裝柱，另取漏蘆花總黃酮提取液20 mL（按藥材量與樹脂用量比2 ∶1），加水稀釋為0.2 g/mL，上樹脂柱，上樣流速為1.0 mL/min，待上樣液流完后即吸附完成后，用3倍量去離子水除雜后，分別用30%、50%、70%、90%的乙醇溶液洗脫至洗脫液無色，洗脫流速為1.0 mL/min，收集洗脫液，減壓濃縮后，定容至100 mL，過0.45 μm微孔濾膜，取過濾后的液體2 mL，按照“ 1.3.1.4 ”方法測定吸光度。

1.3.2.5

漏蘆花總黃酮純化正交試驗。對上樣濃度（g/mL）、上樣pH、上樣液流速（mL/min）、徑高比進行L9（34）不重復正交試驗。正交因素水平表見表2。取漏蘆花總黃酮藥液（1 g/mL）20 mL，分別稀釋至0.05、0.10、0.20 g/mL。取AB-8型大孔樹脂，裝于試驗用的9根樹脂柱中，按表2進行試驗，用3倍量去離子水除雜，然后用50%乙醇洗脫至近無色，收集洗脫液，減壓濃縮至250 mL。取0.4 mL洗脫液按照“ 1.3.1.4 ”方法測定吸光度，計算其總黃酮含量。

1.3.2.6

洗脫劑用量。取漏蘆花總黃酮藥液（1 g/mL）20 mL，按上述所確定的純化工藝操作，用50%乙醇洗脫液，每50 mL（1 BV）收集1份，共收集9份，減壓干燥，分別測得每1 BV總黃酮量占充分洗脫后總黃酮量（充分洗脫后的總黃酮量為4015.38 μg/g）的百分比。

安徽農(nóng)業(yè)科學 2017年

2 結果與分析

2.1 漏蘆花總黃酮提取工藝優(yōu)化

2.1.1

顯色方法與檢測波長的選擇。測定方法的選擇上，該試驗分別比較了NaNO2-Al（NO3）3-NaOH法、AlCl3-NaAc法和三乙胺法，結果表明AlCl3-NaAc法測定漏蘆花總黃酮效果最好。加入NaAc-HAc緩沖液后，槲皮素最大吸收波長由360 nm移至410 nm，漏蘆花供試品由340 nm移至413 nm。故選擇413 nm作為試驗測定波長。

2.1.2

標準曲線的繪制。按照“ 1.3.1.4 ”方法繪制標準曲線，得出回歸方程為Y = 0.064X - 0.147（r= 0.999 2），表明槲皮素對照品在4.8～14.4 μg/mL線性關系良好。

2.1.3

精密度試驗。按照“ 1.3.1.5 ”操作，得到精密度的RSD為1.7%，表明該方法的精密度良好。

2.1.4

穩(wěn)定性試驗。按照“ 1.3.1.6 ”操作，計算得RSD為1.7%，表明該方法在24 h內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

2.1.5

重復性試驗。按照“ 1.3.1.7 ”操作，測得RSD為14%，表明該方法的重復性良好。

2.1.6

加樣回收率。由表3可見，槲皮素的平均加樣回收率為98.4%，RSD為1.2%，表明該方法回收率良好，方法可行。

2.1.7

提取工藝正交試驗。經(jīng)方差分析可知，僅乙醇濃度對提取結果具有顯著性影響，F(xiàn)=6.66>F0.05（2，2）=4.26，P<0.05。由表4可知，各因素對漏蘆花中總黃酮提取量的影響從大到小依次為A、C、D、B，最佳提取方案為A3B3C1D1，即90%乙醇溶液，回流4次，每次回流時間30 min，乙醇用量10倍?？紤]到實際生產(chǎn)中對成本和時間的要求，結合極差分析結果，確定提取的最優(yōu)方案為A2B1C2D2，即75%乙醇溶液，回流2次，每次回流時間45 min，乙醇用量12倍。

2.1.8

提取工藝驗證試驗。精密稱取漏蘆花樣品20 g，共3份，按優(yōu)選的工藝條件進行提取，濃縮溶劑，定容至1 000 mL，分別精密吸取1 mL濃縮液于25 mL容量瓶中，按照“ 1.3.1.4 ”操作，測定吸光度，計算總黃酮含量分別為4 782.31、4 641.25、4 603.42 μg/g（以生藥量計），RSD平均為12%，將濃縮液減壓蒸干，測得干膏中總黃酮含量分別為78%、8.0%、79%。表明該提取工藝重復性良好。

2.2 漏蘆花總黃酮純化工藝研究

2.2.1 樹脂的篩選。綜合吸附率與洗脫率（表5）考慮，確定AB-8 型大孔樹脂純化漏蘆花總黃酮。

2.2.2

泄漏曲線的繪制。以漏蘆花黃酮泄漏量（μg）為縱坐標、上樣液體積為橫坐標繪制泄露曲線。由圖1可知，漏蘆花黃酮類化合物提取液的上樣體積為100 mL時，總黃酮開始泄漏。

2.2.3

洗脫劑濃度的確定。從表6可看出，最終確定乙醇洗脫液濃度為50%。

2.2.4

漏蘆花總黃酮純化正交試驗。經(jīng)方差分析可知， 僅徑高比對純化結果具有顯著性影響，F(xiàn)=14.80>F0.05（2，2）= 4.26，P<0.05。由表7可知，各因素對漏蘆花中總黃酮提取量的影響從大到小依次為D、A、C、B，純化的最優(yōu)方案為A1B3C1D3，即上樣液濃度0.05 g/mL，上樣液pH為5，上樣液流速為1 mL/min，徑高比為1 ∶9。考慮到實際生產(chǎn)中對時間的要求，且上樣液流速對試驗結果無顯著性影響，故最終確定純化的最優(yōu)方案為A1B3C2D3，即上樣液濃度0.05 g/mL，上樣液pH為5，上樣液流速為3 mL/min，徑高比為1 ∶9。

2.2.5

洗脫劑用量。按照“ 1.3.2.6 ”操作，分別測得每1 BV總黃酮量占充分洗脫后的總黃酮量百分比分別為58.3%、18.7%、4.1%、1.5%、1.0%、0.9%、0.9%、0.8%、0.7%，故當50%乙醇洗脫5 BV時，可將總黃酮洗脫完全。

2.2.6

純化工藝驗證試驗。取漏蘆花總黃酮藥液（1 g/mL）20 mL，共3份，按優(yōu)選的工藝條件進行純化，收集洗脫液，定容至250 mL，分別精密吸取1 mL濃縮液于25 mL容量瓶中，按照“ 1.3.1.4 ”漏蘆花總黃酮含量，計算總黃酮含量分別為4 103.45、3 934.22、4 024.57 μg/g，RSD平均為2.2%，將濃縮液減壓蒸干，測得干膏量，計算總黃酮含量，結果干膏中總黃酮含量分別為41.0%、43.6%、42.4%，RSD平均為31%。表明漏蘆花總黃酮經(jīng)AB-8型大孔樹脂純化后，較純化前提高了5倍，且重復性較好。

3 討論與結論

測定方法的選擇上，該試驗分別比較了NaNO2-Al（NO3）3-NaOH法、AlCl3-NaAc法和三乙胺法，結果發(fā)現(xiàn)，第1種方法測定結果偏高，而加入三乙胺處理后標品峰并未發(fā)生紅移或藍移。池玉梅等[13]研究表明，NaNO2-Al（NO3）3-NaOH法并不是黃酮類化合物的專屬反應，因為凡具有鄰苯二羥基的物質(zhì)，均能用此法進行顯色測量；相反，AlCl3法測定時，黃酮類物質(zhì)反應強烈，而對酚酸類、原花色素的反應很小，因而對黃酮類化合物的專屬性較強。故該試驗采用AlCl3-NaAc法。

提取方法預試驗中，采用了超聲提取法、回流法和冷浸法，提取的總黃酮分別為5 522.3、5 901.5和4 003.8 μg/g，故該試驗中使用回流法。

考慮到工業(yè)生產(chǎn)中對洗脫劑的毒性要求和生產(chǎn)成本，該研究選擇乙醇作為洗脫劑。

上樣液濃度考察中發(fā)現(xiàn)，樣品液濃度越高，洗脫過程中流速變緩和柱床堵塞的情況越嚴重，可能是濃度過高導致物質(zhì)析出，沉淀中也含有較多的黃酮類物質(zhì)，故采取直接過濾的方法會造成總黃酮的損失。該試驗采取先稀釋后過濾的方法，柱床堵塞明顯改善，且沉淀中黃酮類物質(zhì)含量顯著減少。

正交試驗表明，各因素對漏蘆花總黃酮提取量的影響從大到小依次為乙醇濃度、回流時間、乙醇用量、回流次數(shù)，確定提取的最優(yōu)方案為75%乙醇溶液，回流2次，每次回流時間45 min，乙醇用量12倍。應用AB-8型大孔吸附樹脂對漏蘆花總黃酮進行富集，通過正交試驗等確定其最佳純化工藝為：上樣液濃度0.05 g/mL，上樣液pH為5，上樣液流速為3 mL/min，徑高比為1 ∶9。該研究為漏蘆花提取純化工藝提供了依據(jù)，也為漏蘆花抗炎有效部位的開發(fā)奠定基礎。

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