謝學強　鄭巧萍　潘石瓊　季磊　周雨青

摘要四川省甘孜州大渡河流域的康定、丹巴、瀘定、九龍等市縣有野生藥用植物黃山藥分布，為滿足其黃山藥市場需求并有效保護其野生資源，需進行組織培養(yǎng)育苗。以黃山藥新生幼嫩帶芽莖段作外植體，從誘導培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)和生根培養(yǎng)方面對黃山藥的組培育苗技術(shù)進行分析，以便形成完整的離體快繁技術(shù)體系。

關(guān)鍵詞黃山藥；組織培養(yǎng)；育苗技術(shù)；大渡河谷

中圖分類號S632.1文獻標識碼A文章編號0517-6611（2017）19-0116-03

Tissue Culture Seedling Technique of Dioscorea Panthcica in Dadu River Valley

XIE Xueqiang，ZHENG Qiaoping， PAN Shiqiong et al

（Department of Environment and Life Science，Sichuan Minzu College，Kangding，Sichuan 626001）

AbstractThere was Dioscorea Panthcica at Kangding，Danba，Luding and Jiulong along Dadu River in Ganzi Prefecture of Sichuan Province.Its tissue culture seedling must be conducted for meeting its market demand and effectively protecting its wild resources.Using tender stem with buds of Dioscorea Panthcica as explants，its tissue culture seeding technique was analyzed from the aspects of induction culture， proliferation culture and rooting culture in order to form a complete system of rapid propagation technology.

Key wordsDioscorea Panthcica；Tissue culture；Seedling technique；Dadu river valley

基金項目四川民族學院四川省省級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練項目（201511661014）。

作者簡介謝學強（1964—），男，四川大竹人，教授，碩士，從事植物資源研究。

收稿日期2017-05-05

黃山藥（Dioscorea panthaica Prain et Burk.），別名姜黃草、黃姜、老虎姜等，是多年生草質(zhì)纏繞藤本，為我國特有的薯蕷科薯蕷屬植物，其根狀莖具有解毒、消腫、止痛等功效，用于治療胃氣痛、吐瀉腹痛、跌打勞傷、瘡瘍腫毒、毒蛇咬傷、淋巴結(jié)核等[1]；其根狀莖含薯蕷皂苷元，是生產(chǎn)治療心血管疾病藥物和合成甾體激素類藥物的重要藥源[2-3]，因此，黃山藥是一種開發(fā)潛力大、經(jīng)濟效益高的藥用植物。近年來黃山藥市場需求量大增，導致其野生資源迅速減少。為滿足市場需求和避免資源枯竭，亟需進行黃山藥人工栽培生產(chǎn)，但其常規(guī)繁殖方法卻消耗大量根狀莖，且繁殖速度慢，育苗質(zhì)量不穩(wěn)定。利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)進行離體快繁能解決常規(guī)繁殖的缺點，已在多種果樹、花卉、蔬菜、藥用植物上廣泛利用[4]，黃山藥組培育苗也具有同樣優(yōu)勢。黃山藥人工栽培時，傳統(tǒng)育苗方法不僅浪費藥用器官（根莖和零余子），而且繁殖率低，難以滿足生產(chǎn)需要。為滿足黃山藥市場需求并有效保護其野生資源，需進行組織培養(yǎng)育苗。筆者從誘導培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)和生根培養(yǎng)方面對黃山藥的組培育苗技術(shù)進行分析，以便形成完整的離體快繁技術(shù)體系，可借以解決人工栽培黃山藥時種苗短缺問題。

1黃山藥的形態(tài)特征、生長習性及分布

1.1形態(tài)特征

黃山藥為纏繞草質(zhì)藤本，莖左旋，光滑無毛，草黃色，有時帶紫色；根狀莖橫生，圓柱形，不規(guī)則分枝，表面著生稀疏須根；單葉互生，葉片三角狀心形，先端漸尖，基部深心形或?qū)捫男?，全緣或邊緣呈微波狀，干燥后表面栗褐色或黑色，背面灰白色，兩面近無毛；花單性，雌雄異株。雄花無梗，新鮮時黃綠色，單生或2～3朵簇生于葉腋組成穗狀花序；苞片舟形；花被碟形，內(nèi)有黃褐色斑點，先端6裂，裂片卵圓形，開放時平展；雄蕊6枚，著生于花被管的基部，背著式花藥。雌花序與雄花序基本相似，花被6裂，具6枚退化雄蕊，花藥不全或僅花絲存在。蒴果三棱形，先端截形或微凹，基部狹圓，表面棕黃色或栗褐色，有光澤，密生紫褐色斑點，成熟時果反曲下垂；種子每室通常2枚，著生于中軸中部。在大渡河谷，黃山藥花期5—7月，果期7—9月。

1.2生長習性

黃山藥以根狀莖越冬。在大渡河谷，每年3月下旬—4月上旬黃山藥根狀莖陸續(xù)出苗；6月中旬枝葉增多，植株進入營養(yǎng)生長旺期；6月底開始孕蕾、開花，新根狀莖開始膨大生長；8—9月新根狀莖生長進入盛期；9月下旬植株生長放緩，進入末花期，根狀莖體積達到一年中最大；10月上旬葉片開始變黃，枯萎脫落，生長停止；11月下旬—12月中旬，地上部分全部枯死；12月—次年3月根狀莖處于休眠狀態(tài)。

1.3分布

黃山藥主要分布在23°21′～31°01′ N、99°24′～113°25′ E，分布區(qū)域有四川西部甘孜州大渡河沿岸的康定、丹巴、瀘定、九龍等市縣，大渡河沿岸的石棉、漢源縣，涼山州、攀枝花市各縣，四川的馬邊、筠連等縣，以及貴州西部、湖南西北部、湖北恩施和云南、廣東等地區(qū)[5]。在大渡河沿岸，黃山藥主要生長于海拔1 000～3 500 m的灌木林下、密林林緣或草地上。

2黃山藥組培育苗技術(shù)

2.1誘導培養(yǎng)

2.1.1接種材料采集及處理。

4月中旬，于大渡河干旱河谷海拔1 400～1 900 m的灌叢、林緣和草地上，連根狀莖帶土采集野生黃山藥，種植于日光溫室中。5月上旬剪取黃山藥新生幼嫩藤蔓，去葉后放入盆中加洗潔精清洗干凈，再放入燒杯中蓋好紗布，置于自來水龍頭下用細流水沖洗4 h以上備用。

2.1.2誘導培養(yǎng)基制備。

2.1.2.1誘導培養(yǎng)基配方。MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+11 g/L瓊脂+30 g/L蔗糖+pH 6.0～6.1。

2.1.2.2母液制備。先按MS基本培養(yǎng)基配方[6]配制大量元素母液（濃縮10倍）、微量元素母液（濃縮100倍）、鐵鹽母液（濃縮100倍）和有機成分母液（濃縮100倍），并配制0.5 mg/mL 的6-芐基腺嘌呤（6-BA）母液和萘乙酸（NAA）母液。各種母液置于冰箱2～4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.2.3固體誘導培養(yǎng)基制備。再按誘導培養(yǎng)基配方配制MS固體誘導培養(yǎng)基。如果配制500 mL，則用藥物天平稱取5.5 g瓊脂條，剪碎放入有500 mL刻度的搪瓷量杯中，加蒸餾水200 mL，置于電爐上加熱溶解，不斷攪拌，防止糊鍋和溢出，直到瓊脂完全溶解；再依次移取50 mL大量元素母液、5 mL微量元素母液、5 mL鐵鹽母液、5 mL有機成分母液、4 mL 6-BA母液、0.1 mL NAA母液加入搪瓷量杯中；再稱量15 g蔗糖加入搪瓷量杯中，待蔗糖溶化后加蒸餾水定容至500 mL；最后用1 mol/L鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至6.0～61，攪拌均勻后趁熱分裝到培養(yǎng)容器（平底試管裝入10 mL，或每個250 mL錐形瓶裝入25 mL）中。培養(yǎng)容器用耐高溫高壓聚乙烯塑料封口膜封口，并用棉線扎緊封口膜。將培養(yǎng)基置于高壓蒸汽滅菌鍋中，在0.1 MPa、121 ℃條件下滅菌10 min。滅菌結(jié)束后自然冷卻，取出培養(yǎng)基置于接種室超凈臺中備用。

2.1.3無菌接種。

2.1.3.1超凈臺滅菌及器械準備。用75%乙醇棉球擦拭超凈工作臺內(nèi)部，再放入誘導培養(yǎng)基、手術(shù)刀、鑷子、醫(yī)用剪刀、酒精燈、打火機、廢液缸、培養(yǎng)皿、無菌濾紙、75%乙醇、75%乙醇棉球、95%乙醇、0.1%升汞、無菌水等，打開鼓風機（中等風速）和紫光燈，20 min后關(guān)閉紫光燈，再10 min后打開白熾燈開始接種黃山藥外植體。

2.1.3.2黃山藥外植體無菌接種。將處理好備用的黃山藥幼嫩莖蔓移入經(jīng)表面消毒的500 mL燒杯中，置于超凈臺里；用75%乙醇棉球擦拭雙手；接著用乙醇棉球按一個方向擦拭超凈臺臺面；點燃酒精燈，將鑷子和手術(shù)刀在火焰上從近手握處向鑷頭或刀頭過火滅菌，滅菌徹底后插入裝有95%乙醇的容器中；向盛裝莖蔓的燒杯中倒入75%乙醇，剛淹沒為度，搖動20 s后將乙醇倒入廢液缸，用無菌水沖洗莖蔓2次，洗液倒入廢液缸；再向盛裝莖蔓的燒杯中倒入0.1%升汞溶液，剛淹沒為度，不時搖動和攪拌，3 min后將升汞液倒入廢液缸，用無菌水沖洗莖蔓5次；于酒精燈火焰旁打開鋪有無菌濾紙的無菌培養(yǎng)皿，平放在酒精燈前臺面上；用冷卻的過火滅菌鑷子夾取莖蔓放到培養(yǎng)皿濾紙上，用過火滅菌手術(shù)刀切取莖蔓為若干莖段，段長1.5 cm左右，至少帶1個節(jié)，節(jié)處于莖段中部為宜，此莖段即為外植體；于酒精燈火焰旁揭開培養(yǎng)基容器封口膜，用冷卻的過火滅菌鑷子夾取外植體，按其形態(tài)學上端朝上的方向平插入培養(yǎng)基中，插入約0.5 cm深；培養(yǎng)容器過火數(shù)秒后迅速套膜捆扎封口。

2.1.4無菌培養(yǎng)。

2.1.4.1培養(yǎng)室消毒。

接種3 d前，測量培養(yǎng)室容積，按高錳酸鉀3 g/m3、福爾馬林3 mL/m3稱量好這2種藥物，關(guān)閉好門窗，在培養(yǎng)室中心放置一個大玻璃缸，依次向其中倒入福爾馬林、高錳酸鉀，并迅速離開，以此進行培養(yǎng)室熏蒸消毒。

2.1.4.2培養(yǎng)條件控制。

將接種好的黃山藥外植體擺放于培養(yǎng)室的培養(yǎng)架上，調(diào)節(jié)光照強度為1 500 lx，光照時間為12 h/d，培養(yǎng)溫度為（25±1） ℃，對黃山藥外植體進行誘導培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中注意撤出污染、褐化和外植體死亡的容器。

2.1.4.3培養(yǎng)結(jié)果。

按“2.1.4.2”方法，培養(yǎng)14 d后，外植體腋芽開始萌動長大，萌芽率為100%；40 d左右多數(shù)外植體抽生出長3～4 cm的無菌短枝，也有15%的外植體誘導出叢生芽。

2.2增殖培養(yǎng)

2.2.1增殖培養(yǎng)基制備。增殖培養(yǎng)基的配方、母液制備方法和固體培養(yǎng)基制備方法與“2.1.2”的相同。

2.2.2無菌接種。

用75%乙醇棉球擦拭誘導培養(yǎng)容器表面，將其放入已消毒滅菌（方法同“2.1.3.1”）的超凈臺中；于酒精燈火焰旁用冷卻的過火滅菌鑷子夾出誘導培養(yǎng)產(chǎn)生的無菌短枝或叢生芽，放在鋪有無菌濾紙的無菌培養(yǎng)皿中，用冷卻的過火滅菌手術(shù)刀切割成若干個帶1個葉和1個腋芽的外植體，轉(zhuǎn)接到制備好的增殖培養(yǎng)基上，形態(tài)學上端朝上，插入培養(yǎng)基約0.5 cm深。

2.2.3無菌培養(yǎng)。

培養(yǎng)條件與“2.1.4.1”和“2.1.4.2”的相同。如此培養(yǎng)8 d后，外植體出現(xiàn)緩慢生長，25 d后多數(shù)單芽形成多芽體，增殖系數(shù)為4.6。如此反復繼代增殖7、8代后形成大量無根苗，再接入生根培養(yǎng)基中生根。

2.3生根培養(yǎng)

2.3.1生根培養(yǎng)基制備。

2.3.1.1

培養(yǎng)基配方。1/2 MS+NAA 0.6 mg/L+活性炭 0.5%+11 g/L瓊脂+30 g/L蔗糖+pH 6.0～6.1。

2.3.1.2

培養(yǎng)基制備。先配制各種母液，方法同“2.1.2.2”。再按生根培養(yǎng)基配方配制MS固體生根培養(yǎng)基。如果配制1 000 mL，則用藥物天平稱取11 g瓊脂條，剪碎放入有1 000 mL刻度的搪瓷量杯中，加蒸餾水400 mL，置于電爐上加熱溶解，不斷攪拌，防止糊鍋和溢出，直到瓊脂完全溶解；再依次移取50 mL大量元素母液、5 mL微量元素母液、5 mL鐵鹽母液、5 mL有機成分母液、1.2 mL NAA母液，加入量杯中；再用藥物天平稱取30 g蔗糖和5 g活性炭加入量杯，攪拌使其溶化均勻后定容至1 000 mL；用1 mol/L鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH至6.0～6.1，攪拌均勻趁熱分裝到培養(yǎng)容器。培養(yǎng)基分裝量、培養(yǎng)容器封口及滅菌方法同“2.1.3.1”。滅菌結(jié)束后自然冷卻，取出培養(yǎng)基置于接種室超凈臺中備用。

2.3.2無菌接種。

增殖培養(yǎng)產(chǎn)生的無根苗長到3 cm以上，或具有3、4片幼葉時，用75%乙醇棉球擦拭增殖培養(yǎng)容器表面，將其放入已消毒滅菌（方法同“2.1.2.3”）的超凈臺中；于酒精燈火焰旁用冷卻的過火滅菌鑷子夾出無根苗，放在鋪有無菌濾紙的無菌培養(yǎng)皿中，用冷卻的過火滅菌手術(shù)刀切除無根苗基部少許老化或腫脹部分，形成新傷口，再轉(zhuǎn)接到制備好的生根培養(yǎng)基上，傷口朝下，插入培養(yǎng)基約0.5 cm深。

2.3.3無菌培養(yǎng)。

培養(yǎng)條件與“2.1.4.1”和“2.1.4.2”的相同。如此培養(yǎng)15 d時傷口附近出現(xiàn)根點，25 d后長出3條以上的不定根，生根率達80%。

3展望

黃山藥人工栽培時，傳統(tǒng)育苗方式是利用根莖和零余子為播種材料，其缺點是播種材料來源少、對藥用部位浪費大、育苗成本高，不是未來黃山藥人工栽培的合適育苗方法。利用大渡河流域野生黃山藥嫩莖進行組培快繁育苗，不僅繁殖迅速、繁殖率高，能夠滿足黃山藥人工栽培用種量，而且能節(jié)省大量根莖用作藥材。但在生產(chǎn)實踐中，一定要想辦法解決好組培育苗時的污染問題，并控制好培養(yǎng)條件。此外，用黃山藥嫩葉作為外植體，經(jīng)愈傷組織途徑誘導叢生芽，進行離體快繁育苗，也有待加強研究。采用組培快繁培育黃山藥種苗用于人工生產(chǎn)，是成本低、效益高的理想途徑，不僅能滿足市場對黃山藥的需求，還能有效保護野生黃山藥資源及其生長地的生態(tài)環(huán)境。

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