崔詩瑤，李 婧，曹海艷，范力博，蘇玉紅

（新疆大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830046）

四環(huán)素是四環(huán)素類廣譜抗菌劑的一種，常用于人畜預(yù)防、治療細(xì)菌性感染疾病，被人畜服用后，70%以上的藥品不能被完全吸收，通常以原藥或代謝產(chǎn)物的形式隨糞尿排出體外[1-2]。據(jù)報(bào)道，2013年中國抗生素年使用量達(dá)16.2萬t，約占世界用量的1/2，其中52%為獸用，48%為人用，超過5萬t抗生素被排放到水土環(huán)境中[3-4]。這些抗生素在環(huán)境介質(zhì)中雖然以痕量水平存在，但是長期暴露在此濃度下的動(dòng)植物、微生物仍會(huì)受到影響，如攜帶抗性基因的抗性細(xì)菌的產(chǎn)生[5-7]，對蔬菜種子發(fā)芽及生長產(chǎn)生影響[8-10]。此外，研究者在肉類[11-12]及蔬菜[13-14]中也檢出了多種抗生素，而研究表明來自食品的抗生素暴露與兒童肥胖發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)之間呈正向相關(guān)[15-16]。

研究報(bào)告表明，土壤中的抗生素能被不同作物吸收并在體內(nèi)不同部位累積[17]，所檢測到的含量為各種抗生素在植物體內(nèi)的累積總量，難以用于判斷抗生素在植物體內(nèi)的吸收、傳輸效率和累積速率；此外，根際分泌物對植物吸收、累積TC的影響尚未見報(bào)道，抗生素在土壤—植物系統(tǒng)內(nèi)的遷移和轉(zhuǎn)換規(guī)律尚未摸清。因此，本研究以酸性水溶液提取-SPE富集濃縮（自制MIP-SPE小柱）-高效液相色譜法測定的方法，擬研究根際暴露時(shí)間不同時(shí)，TC在小白菜、木耳菜和大白菜3種水培蔬菜葉中的含量及其累積速率，考察24 h處理后3種蔬菜不同部位TC含量分布，并初步探索根際分泌物對植物吸收與傳輸TC的影響。研究結(jié)果可為進(jìn)一步研究抗生素在土壤—植物系統(tǒng)中的遷移規(guī)律，建立蔬菜中抗生素遷移模型，對蔬菜中抗生素通過食物鏈帶來的健康風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.2 試驗(yàn)材料

1.2.1 供試蔬菜

小白菜品種：上海青（南京金盛達(dá)種子有限公司），大白菜品種：吉祥美味快菜（青島申榮農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司）。種子經(jīng)H2O2（30%）催芽后用蒸餾水發(fā)芽1周，轉(zhuǎn)移至營養(yǎng)液中培養(yǎng)1個(gè)月備用。木耳菜成株購于烏魯木齊市南公園，在營養(yǎng)液中緩苗1周備用。

1.2.2 供試藥劑

鹽酸四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品（TC，98%），北京百靈威化學(xué)技術(shù)有限公司；乙腈（色譜純），北京百靈威化學(xué)技術(shù)有限公司；甲醇、冰乙酸、鹽酸、磷酸均為分析純，購自天津市百世化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JY92-ⅡN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；TBL80-2B離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；P230Ⅱ高效液相色譜儀配備紫外-可見檢測器（大連依利特股份有限公司）；SHB-III循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；PHS-3C精密pH計(jì)（上海雷磁廠）；FDY2002-SUV超純水儀（富勒姆科技有限公司）。

1.3 HPLC分析條件

Spursil C18色譜柱（5 μm×4.6 mm×250 mm）；檢測波長270 nm；進(jìn)樣量10 μL；流動(dòng)相為乙腈︰0.01 mol/L磷酸水溶液（20︰80，V︰V）。

1.4 抗生素根際暴露試驗(yàn)、樣品采集與前處理方法

試驗(yàn)設(shè)4個(gè)處理，用蒸餾水配制2組不同TC濃度的營養(yǎng)液，濃度分別為5 mg/L和10 mg/L，即為T1和T2；用未處理的預(yù)培蔬菜根際液配制另外2組不同TC濃度的營養(yǎng)液，濃度分別為5 mg/L和10 mg/L，則為T3和T4。4個(gè)處理均用液相色譜法準(zhǔn)確測定溶液中的TC濃度。

將以上4組處理營養(yǎng)液分別裝于玻璃瓶中（瓶外壁涂黑），每瓶溶液體積均為60 mL。把預(yù)選出的生長周期一致、生物量接近的3種蔬菜根部分別置于不同TC濃度處理的玻璃瓶中，每瓶1株，小白菜每個(gè)處理設(shè)4次重復(fù)，木耳菜和大白菜每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。在不同的設(shè)定時(shí)刻（t＝1、3、8、24 h）分別取3種蔬菜的不同部位（根、莖、葉）及營養(yǎng)液0.5 mL，植物樣品經(jīng)洗凈拭干后稱其鮮質(zhì)量，用于測定TC含量。

植物樣品用pH 3.0的蒸餾水研磨，然后超聲提取，提取液離心后取上層清液，用自制的前處理裝置富集后（MIP特異吸附），以甲醇︰乙酸＝9︰1（V︰V）的混合液洗脫，將洗脫液用N2吹至近干，用甲醇定容至0.1 mL后，用HPLC測定洗脫液中的TC含量（加標(biāo)回收率為55.22%～85.81%，RSD＝7.52%，n=9，加標(biāo)濃度10～1 500 μg/kg）；營養(yǎng)液樣品過濾后用HPLC測定TC含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 根際液中TC濃度的變化趨勢

分別測定了不同處理時(shí)間3種蔬菜根際液中TC的濃度變化情況（圖1是T1處理下3種蔬菜根際液中TC濃度變化，其余處理下變化趨勢相同）。隨處理時(shí)間的增加，3種蔬菜根際液TC濃度逐漸降低，小白菜和木耳菜的根際液TC濃度在8～24 h均呈下降趨勢，而大白菜的根際液TC濃度在處理8～24 h內(nèi)趨于穩(wěn)定，可見不同蔬菜對TC的吸收規(guī)律有所不同。

2.2 TC在不同蔬菜根、莖中的含量

圖1 3種蔬菜根際液中TC濃度的變化趨勢

表1 處理24 h后3種蔬菜根、莖中的TC含量

試驗(yàn)結(jié)果表明，3種蔬菜均能吸收累積根外部溶液中的TC。處理24 h后，3種蔬菜體內(nèi)TC的含量如表1所示。根際暴露24 h后，小白菜根中TC含量在T1和T2處理間有顯著性差異，表明根際溶液中TC濃度大小顯著影響根中TC的累積，但根際分泌物可以極大減弱這種影響，使得采用根際液配制的T3和T4處理間的小白菜根中TC無顯著性差異；小白菜莖中TC含量T1和T2處理間無顯著性差異，表明蒸餾水配制的營養(yǎng)液中TC濃度對莖中TC累積無影響，而T4處理莖中TC含量高于T3，且存在顯著差異，T2和T4處理的莖中含量間也存在顯著性差異，表明根際分泌物有利于TC從根部向地上部遷移。在不同處理間大白菜根中的TC含量變化與小白菜表現(xiàn)出相同的規(guī)律，均表現(xiàn)為T2顯著高于T1，T3與T4差異不顯著，可見大白菜與小白菜的根對TC的累積量受蒸餾水配制的外部營養(yǎng)液中TC濃度影響顯著，但不受根際液配制的營養(yǎng)液中TC濃度影響。根外部溶液中TC濃度及溶液條件對木耳菜根、莖中TC含量影響不顯著。

2.3 不同時(shí)間對TC在蔬菜葉中的含量及累積速率的影響

TC在3種蔬菜葉中的累積速率如表2～4所示。試驗(yàn)結(jié)果表明，蔬菜根部能夠快速吸收TC并傳輸至葉片，根際暴露1 h在3種蔬菜葉片中均檢出了較高含量的TC，24 h時(shí)3種蔬菜葉片中TC的含量大小依次為：木耳菜＞大白菜＞小白菜。3種蔬菜葉片中TC的含量受時(shí)間影響較小，使得累積速率不斷減小。

如表2所示，隨著吸收時(shí)間的增長，小白菜葉片中TC含量只有T1變化顯著，在8 h時(shí)達(dá)到最大，顯著大于1 h；在根際暴露24 h后，葉片中TC含量4個(gè)處理之間無顯著性差異，這與其根、莖中TC含量情況有所差異（表1）。小白菜葉片中TC的累積速率隨著時(shí)間的增加呈下降的趨勢，其中T2、T3、T4不同處理時(shí)間的累積速率存在顯著差異。

如表3所示，在不同處理時(shí)間內(nèi)，木耳菜葉片TC含量T1和T2處理呈先下降（1～3 h，差異不顯著）后增加（3～24 h，T1差異不顯著，T2差異顯著）趨勢，T3和T4處理的變化規(guī)律不明顯；根際暴露24 h時(shí)，木耳菜葉片TC含量在同類營養(yǎng)液不同TC濃度處理（T1和T2，T3和T4）之間差異顯著，在不同營養(yǎng)液同一TC濃度處理（T1和T3，T2和T4）之間無顯著性差異，可見木耳菜對TC的累積量受根際營養(yǎng)液中TC濃度的影響較明顯。隨著時(shí)間的增加，木耳菜葉片中的TC累積速率逐漸下降，不同處理根際暴露1 h時(shí)的累積速率均顯著大于3、8、24 h，3 h時(shí)的累積速率均顯著大于8、24 h；而在同一處理時(shí)間，營養(yǎng)液中TC濃度越大，木耳菜葉片TC累積速率越大。

如表4所示，根際暴露24 h時(shí)，大白菜葉片TC含量在同類營養(yǎng)液不同TC濃度處理（T1和T2，T3和T4）之間、不同營養(yǎng)液同一TC濃度處理（T1和T3，T2和T4）之間均無顯著性差異。在不同處理時(shí)間內(nèi)，大白菜葉片中的TC積累速率隨時(shí)間增加而降低，不同處理根際暴露1 h時(shí)的累積速率均顯著大于8、24 h，3 h時(shí)的累積速率也顯著大于8、24 h，而同一處理時(shí)間點(diǎn)各處理TC積累速率均無顯著性差異。

表2 不同處理時(shí)間TC在小白菜葉中的含量和累積速率及其差異性分析

表3 不同處理時(shí)間TC在木耳菜葉中的含量和累積速率及其顯著性分析

表4 不同處理時(shí)間TC在大白菜葉中的含量和累積速率及其顯著性分析

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)結(jié)果表明，3種蔬菜均能吸收累積根外部溶液中的TC，處理1 h內(nèi)即能在小白菜、木耳菜和大白菜葉中檢出較高含量的TC；TC的吸收與累積效率與植物種類相關(guān)，根際暴露24 h后，木耳菜葉中TC含量遠(yuǎn)大于大白菜和小白菜，這與林琳等[18-19]研究蔬菜對抗生素吸收累積的結(jié)果一致。根外部溶液中TC濃度及溶液條件對木耳菜根、莖中TC含量影響不顯著。根對TC的累積受根際溶液中TC濃度的影響，但根際分泌物可能減弱這種影響。根際分泌物與微生物相互作用，參與物質(zhì)循環(huán)與能量流動(dòng)[20]，影響TC在蔬菜中的遷移。

張乙涵等[21]發(fā)現(xiàn)水溶液中不同植物對四環(huán)素的敏感性頻次分布有明顯的差異，不同植物的根伸長和芽伸長對四環(huán)素生態(tài)毒性的敏感順序均為：根伸長＞芽伸長。本試驗(yàn)處理24 h后，4個(gè)處理之間小白菜葉片TC含量無顯著性差異，而莖中TC含量T4與其他3個(gè)處理存在顯著性差異，這與張乙涵[21]等研究不同物種敏感性分布不同的結(jié)果一致。根際分泌物在短期內(nèi)對木耳菜累積TC有一定的影響，可能與植物根系分泌物和根際微生物種群的結(jié)構(gòu)與功能的差異[22]等因素有關(guān)。營養(yǎng)液中TC濃度越大，木耳菜葉片對TC的累積速率越大，這與鮑艷宇等[23]的研究成果相似，小麥的根伸長抑制率或芽伸長抑制率與抗生素的濃度之間均存在明顯的劑量—效應(yīng)關(guān)系。大白菜葉片TC累積速率隨處理時(shí)間增加而逐漸降低，可見根際分泌物對大白菜TC累積速率有抑制作用。可是因?yàn)楦H分泌物與周圍環(huán)境產(chǎn)生根際效應(yīng)，影響根際微生物的生態(tài)分布、種群組成，進(jìn)而對植物根系活性表現(xiàn)出促進(jìn)或抑制作用[23]。

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