馮杰,夏祥國(guó),陳禮剛，陳銳，江勇，張彪，宋志富

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 神經(jīng)外科，四川 瀘州 646000)

·論 著·

HEPN1過表達(dá)慢病毒的構(gòu)建及對(duì)人泌乳素型垂體瘤細(xì)胞的影響

馮杰,夏祥國(guó),陳禮剛，陳銳，江勇，張彪，宋志富

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 神經(jīng)外科，四川 瀘州 646000)

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 HEPN1過表達(dá)慢病毒載體構(gòu)建與包裝

1.2.2 HPAs細(xì)胞培養(yǎng)和慢病毒感染

HPAs細(xì)胞用RM 1640加10%FBS、100 IU·L-1青霉素、100 mg·L-1鏈霉素于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隔天更換培養(yǎng)液，細(xì)胞生長(zhǎng)至85%融合時(shí)，0.25%胰蛋白酶消化、傳代。慢病毒感染實(shí)驗(yàn)分為HEPN1組、空質(zhì)粒組和空白組3組。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HPAs細(xì)胞接種于6孔板，感染6 h后棄去感染液，更換RM 1640加10%FBS的正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。72 h后熒光顯微鏡觀察細(xì)胞綠色熒光蛋白表達(dá)，并收集各組細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3.1 RNA提取 穩(wěn)定表達(dá)的HPAs細(xì)胞接種于6孔板，孵育48 h后收集各組細(xì)胞。Trizol法提取細(xì)胞總RNA。

1.2.4 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)蛋白質(zhì)表達(dá)

1.2.5 噻唑藍(lán)比色法(MTT法)和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞增殖及凋亡

1.2.5.1 MTT法 穩(wěn)定表達(dá)的HPAs細(xì)胞接種于96孔板。分別于接種后的24、48、72、96、120 h，每孔加入20 μl的MTT溶液(5 mg·μl-1)。繼續(xù)孵育4 h后，小心吸掉培養(yǎng)基，每孔再加入二甲基亞砜150 μl，室溫振搖15 min，酶標(biāo)儀測(cè)定各組OD570 nm值并繪制曲線。

1.2.6 細(xì)胞侵襲和劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲和遷移

1.2.6.1 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 取穩(wěn)定表達(dá)的HPAs細(xì)胞，使用無血清的RM 1640培養(yǎng)基將細(xì)胞接種于自帶基質(zhì)膠的小室上室，下室加入RM 1640加10%FBS。孵育48 h后，擦去靠近基底膜內(nèi)室的細(xì)胞，另一面細(xì)胞經(jīng)10%甲醇固定，磷酸鹽緩沖液洗滌，結(jié)晶紫染色，磷酸鹽緩沖液洗滌，顯微鏡下觀察細(xì)胞并計(jì)數(shù)。

1.2.6.2 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 取穩(wěn)定表達(dá)的HPAs細(xì)胞接種于6孔板，細(xì)胞生長(zhǎng)至90%融合時(shí)，于6孔板底部沿直線劃痕，并更換為無血清的RM 1640培養(yǎng)基。孵育48 h后，4%多聚甲醛固定30 min，Gimesa染色，觀察細(xì)胞遷移情況，細(xì)胞相對(duì)遷移能力=0 h劃痕距離-48 h 劃痕距離。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 HEPN1過表達(dá)細(xì)胞的建立

感染72 h后，熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白表達(dá)，HEPN1組和空質(zhì)粒組感染效率分別為90.3%和92.5%，空白組未見綠色熒光蛋白表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見圖1。HEPN1組HEPN1的mRNA表達(dá)(1.27±0.33)高于空質(zhì)粒組(0.25±0.08)和空白組(0.37±0.14)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=34.559，P<0.05)；HEPN1蛋白表達(dá)(1.54±0.41)高于空質(zhì)粒組(0.53±0.19)和空白組(0.49±0.15)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=23.425，P<0.05)。詳見圖2。

圖1 熒光顯微鏡觀察各組細(xì)胞綠色熒光蛋白表達(dá)

a 與空質(zhì)粒組和空白組比較，P<0.05

a 與空質(zhì)粒組和空白組比較，P<0.05

a 與空質(zhì)粒組和空白組比較，P<0.05

2.4 MTT法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞增殖和凋亡

細(xì)胞生長(zhǎng)曲線顯示，HEPN1組第12、24、36、48、72 h時(shí)的OD570 nm值顯著低于空質(zhì)粒組和空白組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示HEPN1組細(xì)胞的增殖能力明顯降低，詳見圖5。雙變量流式細(xì)胞儀散點(diǎn)圖可見，HEPN1組細(xì)胞總凋亡率(31.28%)顯著高于空質(zhì)粒組(13.27%)和空白組(17.43%)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見圖6。

2.5 細(xì)胞侵襲和劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲和遷移

細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)顯示，HEPN1組穿膜細(xì)胞數(shù)目(21.27±8.41)個(gè)，顯著少于空質(zhì)粒組的(71.24±15.83)個(gè)和空白組的(66.72±14.46)個(gè)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=21.602，P<0.05)，提示HEPN1組細(xì)胞侵襲能力顯著下降，詳見圖7。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)顯示，HEPN1組細(xì)胞遷移距離為(497.33±45.28)μm，較空質(zhì)粒組的(858.25±74.16)μm和空白組的(893.27±68.53)μm差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=58.846，P<0.05)，提示HEPN1組細(xì)胞遷移能力顯著下降，詳見圖8。

a 與空質(zhì)粒組和空白組比較，P<0.05

圖5 MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖

3 討 論

國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者對(duì)垂體瘤作了大量研究，大部分學(xué)者認(rèn)為原癌基因激活和抑癌基因失活是其形成的重要前提條件。抑癌基因HEPN1在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中扮演重要角色。Mei等[6]發(fā)現(xiàn)，HEPN1在原發(fā)性肝癌組織中的表達(dá)低于正常肝組織；過表達(dá)HEPN1可抑制肝癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡。Hu等[7]研究證實(shí)：侵襲性垂體腺瘤組織中HEPN1表達(dá)低于非侵襲性組織；干擾HEPN1表達(dá)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，抑制其凋亡，并促進(jìn)其侵襲能力。

Q1.中晚期凋亡細(xì)胞；Q2.壞死細(xì)胞；Q3.存活細(xì)胞；Q4.早期凋亡細(xì)胞

a 與空質(zhì)粒組和空白組比較，P<0.05

圖6 Annexin Ⅴ/PI雙染色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況

為研究HEPN1在垂體瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用，本研究利用慢病毒載體轉(zhuǎn)染人泌乳素型垂體瘤細(xì)胞HPAs，觀察過表達(dá)HEPN1對(duì)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。本研究成功構(gòu)建了HEPN1過表達(dá)慢病毒，并感染人HPAs細(xì)胞。結(jié)果顯示，HEPN1組細(xì)胞HEPN1的表達(dá)顯著高于空質(zhì)粒組和空白組，提示已成功建立穩(wěn)定過表達(dá)HEPN1的HPAs細(xì)胞。對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，HEPN1組細(xì)胞的增殖受到明顯抑制，細(xì)胞凋亡率顯著增加。對(duì)細(xì)胞侵襲和遷移能力的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，HEPN1組穿膜細(xì)胞數(shù)目和細(xì)胞遷移距離顯著減少。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，過表達(dá)HEPN1可以抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡，降低其侵襲和遷移能力。

a 與空質(zhì)粒組和空白組比較，P<0.05

圖7 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞的侵襲能力 ×100

a 與空質(zhì)粒組和空白組比較，P<0.05

圖8 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞的遷移能力 ×100

Construction of overexpression lentivirus targeting HEPN1 gene and its effects on biological behavior in pituitary tumor cells HPAs

(DepartmentofNeurosurgery，theAffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity，Luzhou646000，China)

R736.4

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