劉宏，顧頁(yè)，蔡盈盈，余衛(wèi)平

(東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院 病理學(xué)與病理生理學(xué)系，江蘇 南京 210009)

·論 著·

蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶SET7/9表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、凋亡和遷移的影響

劉宏，顧頁(yè)，蔡盈盈，余衛(wèi)平

(東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院 病理學(xué)與病理生理學(xué)系，江蘇 南京 210009)

肝癌細(xì)胞； SET7/9； 細(xì)胞增殖； 凋亡； 遷移

1 材料與方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 參考SuperFectinTMⅡ轉(zhuǎn)染試劑操作說(shuō)明書。按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞分組接種于6孔培養(yǎng)板中，每組2孔，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。當(dāng)細(xì)胞貼壁且融合度達(dá)80%時(shí)，將1 μg質(zhì)粒與3 μl轉(zhuǎn)染試劑在無(wú)血清培養(yǎng)基中混勻后室溫靜置15 min，再均勻地加入待轉(zhuǎn)染培養(yǎng)細(xì)胞中孵育6 h，棄去培養(yǎng)液，加入新的完全培養(yǎng)液。轉(zhuǎn)染后48 h當(dāng)熒光顯微鏡下觀察到轉(zhuǎn)染效率達(dá)75%時(shí)，采用蛋白免疫印跡法檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果。

1.2.4 細(xì)胞增殖檢測(cè) 將經(jīng)檢測(cè)轉(zhuǎn)染有效的細(xì)胞消化制備單細(xì)胞懸液并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，每孔加100 μl細(xì)胞懸液，保證細(xì)胞均勻分布，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，同時(shí)將其種于96孔板，密度為每孔1 000～2 000個(gè)細(xì)胞，分別于24、48、72、96 h按凋亡試劑盒說(shuō)明每孔加入10 μl CCK8凋亡試劑，放入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 h，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處各測(cè)量孔的OD值以觀察其增殖能力。

1.2.6 Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 用8.0 μm膜，上室加入300 μl不含血清及抗體的高糖DMEM培養(yǎng)基及用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸的2.0×105個(gè)腫瘤細(xì)胞，下室加入含10%胎牛血清、100 U·ml-1青霉素、100 U·ml-1鏈霉素的高糖的DMEM培養(yǎng)基400 μl，腫瘤細(xì)胞會(huì)向含有細(xì)胞因子、趨化因子營(yíng)養(yǎng)成分高的下室遷移，計(jì)數(shù)進(jìn)入下室的細(xì)胞量可反映腫瘤細(xì)胞的遷移能力。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 肝癌細(xì)胞株中SET7/9表達(dá)狀況

a 與正常肝細(xì)胞比較，P<0.05；b 與正常肝細(xì)胞比較，P<0.01

圖1 正常肝細(xì)胞株與肝癌細(xì)胞株中SET7/9表達(dá)狀況

Fig 1 Expression of SET7/9 in normal hepatic and four hepatoma cell lines

b 與對(duì)照組比較，P<0.01

圖2 兩株肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染不同質(zhì)粒后SET7/9表達(dá)狀況

Fig 2 Expression of SET7/9 in two liver cancer cell lines transfected with different plasmids

a 與對(duì)照組比較，P<0.05

圖3 SET7/9表達(dá)變化對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響

Fig 3 Effects of altered SET7/9 expression on proliferation of liver cancer cells

aP<0.05

2.5 SET7/9表達(dá)對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞遷移力的影響

bP<0.01

圖5 SET7/9表達(dá)變化對(duì)肝癌細(xì)胞遷移力的影響

Fig 5 Effects of altered SET7/9 expression on migration of liver cancer cells

3 討 論

SET7/9也稱為SET7或SET9，這種稱呼上的差別源于最初報(bào)道者的不同命名，其表達(dá)基因位于染色體4q28，蛋白產(chǎn)物含保守的SET結(jié)構(gòu)域，相對(duì)分子質(zhì)量約為50[3- 4]。研究發(fā)現(xiàn)，SET7/9除了能甲基化組蛋白外，還能使轉(zhuǎn)錄因子、腫瘤抑制因子、膜相關(guān)受體等非組蛋白甲基化[7]。SET7/9所介導(dǎo)的不同非組蛋白賴氨酸甲基化能引發(fā)多種細(xì)胞效應(yīng)包括蛋白穩(wěn)定性改變和基因表達(dá)變化，與染色體結(jié)構(gòu)維持、細(xì)胞增殖及凋亡調(diào)控等相關(guān)[3]。

本研究觀察到的肝癌細(xì)胞中SET7/9表達(dá)狀況及其表達(dá)改變對(duì)細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，無(wú)疑有助于進(jìn)一步闡明SET7/9的腫瘤細(xì)胞效應(yīng)。最近，Song等[7]發(fā)現(xiàn)乳腺癌細(xì)胞中SET7/9表達(dá)降低會(huì)促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移及侵襲力，SET7/9過(guò)表達(dá)可抑制細(xì)胞增殖、遷移及侵襲。Yoshimitsu等[10]發(fā)現(xiàn)原發(fā)性胃癌細(xì)胞中SET7/9明顯降低，抑制胃癌細(xì)胞中SET7/9表達(dá)會(huì)促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，證明SET7/9有抑制胃癌細(xì)胞的作用。顯然，這些結(jié)果與我們及其他研究者在人肝癌細(xì)胞、人肺癌細(xì)胞和人卵巢癌細(xì)胞等觀察到的情況并不一樣，表明SET7/9對(duì)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)調(diào)控具有雙重性，在不同組織類型腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)不同效應(yīng)。

至于肝癌細(xì)胞中SET7/9表達(dá)如何引起細(xì)胞增殖、凋亡及遷移力變化，我們認(rèn)為涉及SET7/9對(duì)非組蛋白賴氨酸單甲基化修飾的胞內(nèi)蛋白功能調(diào)控機(jī)制。由于不同組織類型腫瘤中SET7/9對(duì)一些重要因子的甲基化作用或增加(如p53、ER)或降低(如p65、DNMT1)蛋白穩(wěn)定性，或促進(jìn)其空間變構(gòu)(如AR)，繼而改變它們的轉(zhuǎn)錄活性，影響靶基因表達(dá)[3]，這會(huì)誘發(fā)不同類型細(xì)胞不同的細(xì)胞生長(zhǎng)與行為學(xué)效應(yīng)。通過(guò)深入研究SET7/9調(diào)控肝癌細(xì)胞的增殖、凋亡和遷移的具體機(jī)制，有望讓SET7/9成為新的肝癌診斷生物標(biāo)志物與治療藥物作用靶點(diǎn)。

[5] 汪淵.蛋白甲基化修飾酶SET7/9對(duì)p53缺失人肺癌細(xì)胞的凋亡效應(yīng)及其機(jī)制[D].南京：東南大學(xué),2014.

Effects of protein lysine methylation transferase SET7/9 expression on proliferation,apoptosis and migration of liver cancer cells

(DepartmentofPathologyandPathophysiology,SchoolofMedicine,SoutheastUniversity,Nanjing210009,China)

hepatic cancer cell; SET7/9; cell proliferation; apoptosis; migration

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81071654)

R735.7； R318

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