白若靖，高華斌，韓召利，黃山，葛歆瞳，陳芳蓮，雷平

[1.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院 保健醫(yī)療部(老年病科)，天津市老年病學(xué)研究所，天津 300052；2.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院 神經(jīng)外科，天津市神經(jīng)病學(xué)研究所，天津 300052]

·論 著·

大鼠反復(fù)輕度腦創(chuàng)傷后外周血中T細(xì)胞亞群的變化

白若靖1，高華斌2，韓召利1，黃山2，葛歆瞳2，陳芳蓮2，雷平1

[1.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院 保健醫(yī)療部(老年病科)，天津市老年病學(xué)研究所，天津 300052；2.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院 神經(jīng)外科，天津市神經(jīng)病學(xué)研究所，天津 300052]

目的：探討大鼠反復(fù)輕度腦創(chuàng)傷(rmTBI)后外周血中T細(xì)胞亞群的變化及其意義。方法：選擇SD大鼠，采用控制性腦皮質(zhì)撞擊法(CCI)制作rmTBI大鼠模型，隨機(jī)分為假手術(shù)對(duì)照組以及損傷后1、2、4、6周組共5組，每組8只，通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組大鼠1、2、4、6周時(shí)外周血中CD3+、CD4+、CD8+細(xì)胞百分率。結(jié)果：CD3+T細(xì)胞百分率在1、2周均有顯著上升，在4、6周均有顯著下降(P<0.05)。CD4+T細(xì)胞百分率在傷后持續(xù)下降(P<0.05)；CD8+T細(xì)胞百分率在傷后1～4周逐漸上升(P<0.05)。結(jié)論：rmTBI模型大鼠在傷后存在免疫功能紊亂，這為rmTBI傷后存在外周免疫抑制提供了新的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，其慢性期外周免疫抑制可能對(duì)疾病的預(yù)后產(chǎn)生重要影響。

反復(fù)輕度腦創(chuàng)傷； T細(xì)胞亞群； 免疫功能； 大鼠外周血； 免疫抑制

腦創(chuàng)傷(traumatic brain injury，TBI)是危險(xiǎn)性較高的創(chuàng)傷類型，主要包括原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷，其因高發(fā)生率、高致殘率、高死亡率而嚴(yán)重危害著人類健康。繼發(fā)性損傷是指局部腦組織和外周微環(huán)境中相關(guān)炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答，其中免疫系統(tǒng)對(duì)TBI影響已成為近來(lái)研究的熱點(diǎn)[1]。其中，慢性創(chuàng)傷性腦病(CTE)是與反復(fù)輕度腦創(chuàng)傷(repetitive mild traumatic brain injury，rmTBI)相關(guān)的一種神經(jīng)退行性疾病，常見于拳擊運(yùn)動(dòng)員、退伍士兵等[2]。以往的研究主要局限于嚴(yán)重TBI外周免疫變化，但CTE相關(guān)的rmTBI外周免疫如何變化尚未明確。本研究應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)rmTBI模型大鼠外周血中T細(xì)胞亞群CD3+、CD4+、CD8+的變化，以了解CTE相關(guān)rmTBI中急慢性期的外周免疫反應(yīng)，為進(jìn)一步探討CTE相關(guān)rmTBI作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑

1.2 顱腦損傷動(dòng)物模型建立及分組

采用控制性腦皮質(zhì)撞擊法(CCI)制備大鼠rmTBI模型，以3.5 ml·kg-110%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，固定后備皮消毒切開，分離顱骨與肌肉筋膜，于顱中線偏右3 mm、后顱線前4 mm開一直徑為4 mm的骨窗，顯微鑷去除骨瓣后置于CCI損傷儀下，應(yīng)用PinPointTMPCI3000精細(xì)顱腦撞擊儀(Hatteras Instruments Inc．USA)設(shè)定輕型顱腦損傷打擊參數(shù)，使用直徑為2.5 mm的打擊頭精確撞擊小鼠腦皮質(zhì)(打擊深度為3.6 mm、打擊時(shí)間為100 ms、打擊速度為1.2 m·s-1)，消毒縫合后置于電熱毯上維持體溫。每隔24 h再進(jìn)行上述打擊，共重復(fù)4次。大鼠按照隨機(jī)原則分為假手術(shù)對(duì)照組和損傷后1、2、4、6周組共5組，每組8只。假手術(shù)對(duì)照組除不作打擊處理外，其余處理均與實(shí)驗(yàn)組相同。

1.3 標(biāo)本采集

各組大鼠在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)(損傷后1、2、4、6周)留取血樣，均用EDTA抗凝管心臟采血約2 ml，立即輕微顛倒混勻后進(jìn)行免疫學(xué)分析。

1.4 流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)外周血CD3+、CD4+、CD8+細(xì)胞表達(dá)

1.4.1 大鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)分離 獲取大鼠PBMC。(1)EDTA抗凝管常規(guī)采集大鼠外周血新鮮標(biāo)本3 ml；(2)抗凝血與PBS緩沖液1∶1混勻，各3 ml；(3)15 ml離心管中加入大鼠淋巴細(xì)胞分離液9 ml，稀釋后的血液緩慢加入到分離液表層，避免混合;(4)于離心機(jī)4 ℃下1 800 r·min-1離心30 min(升3降3)；(5)離心后離心管中混合液分為4層(從下到上依次為紅細(xì)胞、大鼠淋巴細(xì)胞分離液、單個(gè)核細(xì)胞層、血漿與PBS)，吸取中間白膜層(單個(gè)核細(xì)胞層)置于新的15 ml離心管中，與PBS緩沖液混勻后4 ℃下2 000 r·min-1離心10 min(升10降10)，進(jìn)行第1次洗滌；(6)與PBS緩沖液混勻后2 000 r·min-1離心10 min；(7)離心棄上清，PBS重懸后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106個(gè)·ml-1，得到大鼠PBMC標(biāo)本[3]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 22．0統(tǒng)計(jì)軟件分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 rmTBI大鼠外周血中T細(xì)胞亞型CD3+、CD4+、CD8+的表達(dá)

各時(shí)間點(diǎn)大鼠外周血中T細(xì)胞亞型CD3+、CD4+、CD8+的檢測(cè)結(jié)果見表1。傷后1、2周大鼠外周血中CD3+T細(xì)胞表達(dá)水平顯著高于假手術(shù)對(duì)照組(P<0.05)，而傷后4、6周顯著低于假手術(shù)對(duì)照組(P<0.05)。CD4+T細(xì)胞占T細(xì)胞的百分率在傷后1～6周持續(xù)下降，與假手術(shù)對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；CD8+T細(xì)胞占T細(xì)胞的百分率在傷后1～4周逐漸上升，與假手術(shù)對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討 論

表1 rmTBI大鼠外周血中T細(xì)胞亞型CD3+、CD4+、CD8+的表達(dá) %

Tab 1 Changes of T lymphocyte subsets CD3+，CD4+，CD8+ in the peripheral blood of rats after rmTBI %

a 與假手術(shù)對(duì)照組比較，P<0.05

PBMC富含各種免疫活性細(xì)胞，主要為T細(xì)胞，其中CD3+代表總T淋巴細(xì)胞，分為調(diào)節(jié)免疫活性的輔助性T細(xì)胞亞群CD4+和抑制性T細(xì)胞亞群CD8+。其中CD4+T淋巴細(xì)胞促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖與分化，同時(shí)參與并協(xié)調(diào)各免疫細(xì)胞間的相互作用，而CD8+T淋巴細(xì)胞則作用相反。CD4+/CD8+值作為重要的免疫調(diào)節(jié)的標(biāo)志，反映免疫系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定性[10]。

本研究結(jié)果表明，rmTBI慢性期存在顯著的免疫抑制，這可能與傷后血腦屏障的破壞具有密切關(guān)系[11],這與之前報(bào)道的嚴(yán)重TBI后外周免疫抑制[5- 6,12- 13]相類似。另外，研究發(fā)現(xiàn)脊髓損傷(spinal cord injuries，SCI)慢性期的免疫抑制狀態(tài)可長(zhǎng)達(dá)3個(gè)月[14- 15]。本研究外周免疫抑制這一現(xiàn)象可能的原因如下：(1)傷后激活的交感神經(jīng)系統(tǒng)(sympathetic nervous system，SNS)導(dǎo)致脾臟的收縮[16]，進(jìn)而造成相關(guān)免疫功能的紊亂[17]，兩者相互促進(jìn)，并加重免疫抑制的程度[18]。(2)傷后激活的下丘腦-垂體-腎上腺軸[19- 20],導(dǎo)致外周糖皮質(zhì)激素、兒茶酚胺水平增高和髓系抑制性細(xì)胞(myeloid derived suppressor cells，MDSCs)的增殖，進(jìn)一步抑制T細(xì)胞的相關(guān)功能。(3)損傷的神經(jīng)元經(jīng)血腦屏障滲漏進(jìn)入外周血，進(jìn)一步促進(jìn)MDSCs的增殖和淋巴細(xì)胞的減少[21]。故這一中樞神經(jīng)損傷誘導(dǎo)的免疫缺陷，增加了感染的易感性并影響著神經(jīng)功能的預(yù)后。

本研究首次發(fā)現(xiàn)大鼠rmTBI模型傷后外周血中T細(xì)胞亞群CD3+、CD4+、CD8+的變化，為rmTBI傷后存在外周免疫抑制提供了新的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，但這一現(xiàn)象是否持續(xù)存在以及其他免疫細(xì)胞(如Treg、Th17、NK細(xì)胞等)表達(dá)的變化仍有待進(jìn)一步研究。此外，本研究為rmTBI相關(guān)的CTE疾病研究提供了新的視角，并為改善神經(jīng)退行性疾病的預(yù)后開辟了新的途徑。

[3] 孔曉冬.自然殺傷細(xì)胞在創(chuàng)傷性腦損傷中的變化研究[D].天津：天津醫(yī)科大學(xué)，2014.

[11]JIN X,ISHII H,BAI Z,et al.Temporal changes in cell marker expression and cellular infiltration in a controlled cortical impact model in adult male C57BL/6 mice[J].PLoS One,2012,7(7):e41892.

[21]HAZELDINE J,LORD J M,BELLI A.Traumatic brain injury and peripheral immune suppression:primer and prospectus[J].Front Neurol,2015,6:235.

Kinetics of T lymphocyte subsets in the peripheral blood of rats following repetitive mild traumatic brain injury

(1.DepartmentofGeriatrics,TianjinMedicalUniversityGeneralHospital,TianjinGeriatricsInstitute,Tianjin300052,China； 2.DepartmentofNeurosurgery,TianjinMedicalUniversityGeneralHospital,TianjinNeurologicalInstitute,Tianjin300052,China)

repeated mild traumatic brain injury；T lymphocyte subsets；immune function；peripheral blood of rats；immune suppression

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81471252)；天津市科委自然基金面上項(xiàng)目(13JCYBJC23700)；國(guó)家青年自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81501055)

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