肖懿哲, 朱友芳, 孫玉龍, 張 鑫, 張子平, 王藝磊

(1. 莆田市水產(chǎn)科學(xué)研究所, 福建 莆田 351100; 2. 集美大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院, 福建 廈門 361021; 3. 福建農(nóng)林大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院, 福建 福州 350002)

施氏鱘Asnanos1基因序列分析及其在雌雄不同組織中表達

肖懿哲1, 朱友芳1, 孫玉龍2, 張 鑫3, 張子平3, 王藝磊2

(1. 莆田市水產(chǎn)科學(xué)研究所, 福建 莆田 351100; 2. 集美大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院, 福建 廈門 361021; 3. 福建農(nóng)林大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院, 福建 福州 350002)

本研究首先從施氏鱘(Acipenser schrenckii)性腺轉(zhuǎn)錄組中獲得nanos1(Asnanos1)基因全長cDNA,并對其序列的準確性和特征分別進行PCR驗證和生物信息學(xué)分析。進一步利用熒光定量RT-PCR技術(shù)檢測Asnanos1基因在雌、雄施氏鱘的性腺、心臟、鰓、腦、腎、肝臟、脾臟等組織中的表達量。利用熒光定量RT-PCR技術(shù)檢測Asnanos1基因在雌、雄施氏鱘的性腺、心臟、鰓、腦、腎、肝臟、脾臟等組織中的表達量。結(jié)果顯示: Asnanos1的cDNA 全長為1 389 bp, 其中, 5′非編碼區(qū)(UTR)為414 bp, 3′UTR為279 bp, ORF為696 bp。該基因共編碼231個氨基酸。Asnanos1基因在施氏鱘除心臟以外的各組織中均有表達, 在雌、雄魚的鰓、腦、腎、肝臟、脾臟等組織中表達量無顯著差異, 但在卵巢中的表達量顯著高于其他各組織(P＜0.05)。所得到的結(jié)果可為人工培育全雌施氏鱘苗種提供一些基礎(chǔ)資料。

施氏鱘(Acipenser schrenckii); nanos1基因; 熒光定量RT-PCR; 雌雄個體組織; 基因表達

母源效應(yīng)基因nanos最早在果蠅(Drosophila melanogaster)中被發(fā)現(xiàn), nanos基因參與前后體軸的建立、原始生殖細胞的遷移和維持, 并對生殖干細胞的分化及性別分化有一定的作用[1]。目前的研究結(jié)果表明, 每個物種至少含有1個nanos基因同源物, 不同的物種具有不同數(shù)目的nanos基因同源物[2-7], 同一物種不同nanos基因同源物所發(fā)揮的功能存在著顯著差異。迄今anos1的功能報道還不多, 在線蟲(Caenorhabditis elegans)nanos基因中, 有3種nanos同源物, 其中nanos1主要在生殖細胞發(fā)育和維持中發(fā)揮作用[2]; 在小鼠(Mus musculus)中, nanos1表達于胚胎和成體的腦中以及成熟精巢的曲精小管中,原始生殖細胞中未見表達且nanos1缺陷的小鼠中生殖細胞發(fā)育也并未受到影響[8]; 在青鳉(Oryzias latipes)胎發(fā)育時, nanos1a和nanos1b主要表達于頭部等區(qū)域, 并未在原始生殖細胞中表達[9]?？梢妌anos1在不同物種中表達方式不同, 作用也存在差異。魚類性別分化除受到如激素、環(huán)境條件、遺傳等因素的影響外, 原始生殖細胞也發(fā)揮了重要作用[10], 為了分析魚類nanas1基因與原始生殖細胞及性別分化的關(guān)系, 進行魚類nanas1基因克隆及在雌雄不同組織中表達的研究是有必要的。目前已克隆出幾種魚類的nanos1基因, 如斑點雀鱔(Lepisosteus oculatus, 登錄號: XP_006630660.1)、黑脊倒刺鲃(Spinibarbu. caldwelli)[11]、中華鱘(Aclpenser Sinensis, 登錄號: AFD10415.1)[12]、矛尾魚(Latimeria chalumane, 登錄號: XP_005999283.1)鳉、青(登錄號: ABU63571.1)[9]等。但施氏鱘(Acipenser schrenckii)nanas1基因(Asnanos1)克隆及在雌雄不同組織中表達未見報道。

施氏鱘是中國黑龍江水系特有珍稀名貴的大型經(jīng)濟魚類[13], 目前在施氏鱘養(yǎng)殖中, 施氏鱘雄魚作為魚肉銷售, 而施氏鱘雌魚則用于生產(chǎn)魚籽醬。隨著鱘魚養(yǎng)殖的發(fā)展, 鱘魚養(yǎng)殖的重點己從生產(chǎn)商品魚向生產(chǎn)高附加值的魚籽醬轉(zhuǎn)變[14], 因此人工培育全雌苗種具有重要的理論價值及現(xiàn)實意義, 本研究對Asnanos1進行克隆、測定Asnanos1在雌雄不同組織中的表達水平, 以期為施氏鱘性別分化機制的研究及人工培育全雌施氏鱘苗種提供一些基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2014年12月, 在福建莆田一水產(chǎn)養(yǎng)殖場。采集體質(zhì)量為2.5～3.5 kg 3齡的雌雄施氏鱘各5尾, 參照高艷麗[15]對施氏鱘性腺發(fā)育階段的分期, 本研究采集雌雄施氏鱘性腺發(fā)育階段均為二期, 解剖取精巢、卵巢、心臟、鰓、腦、腎、肝臟、脾臟等組織在液氮中速凍后于–80℃冰箱中保存。

1.2 總RNA提取與模板制備

提取施氏鱘精巢、卵巢、心臟、鰓、腦、腎、肝臟、脾臟等不同的組織的RNA, 提取過程及模板制備參照李文輝等[16]實驗方法。從Promega公司購買逆轉(zhuǎn)錄所用的M-MLV酶。

1.3 Asnanos1序列驗證

在本課題組完成的施氏鱘性腺(雌雄混合)高通量轉(zhuǎn)錄組測序的數(shù)據(jù)中(由北京百邁客生物科技有限公司采用PE125測序方法進行高通量轉(zhuǎn)錄組測序), 獲得了Asnanos1的全長序列, 采用驗證引物1(Asnanos1-F1: ATGACGGAAACTTTTCACACA-GTGG, Asnanos1-R1: TTAACGATTTTTTTTCCC-GATG-ATG)對其開放閱讀框(ORF)的準確性進行驗證, 采用驗證引物2(Asnanos1-F2: TTTGATTAAGTAATTGAGAAG, Asnanos1-R2: CAGTACATGTTCTTCATAC)對其非編碼區(qū)(UTR)的準確性進行驗證。實驗所用引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.4 目的基因的生物信息學(xué)分析

對Asnanos1的全長序列分別使用Blast(http: // blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)和ORF Finde(http: // www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/orfig.cgi)等工具驗證所得序列是否為目的基因。使用ExPASy (http: // web.expasy.org/compute_pi/)預(yù)測蛋白的等電點及分子量。可能的磷酸化位點使用NetPhos 2.0 Server (http: //www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)進行預(yù)測。通過使用SWISS-MODEL(http: //swissmodel.expasy. org/)進行三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測。序列的多重比對通過BioEdit軟件進行, 隨后使用MEGA5.0軟件完成系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建。

1.5 熒光定量RT-PCR

在進行熒光定量RT-PCR(羅氏公司LightCycler 480實時定量PCR儀)測定時每個樣品設(shè)置3個平行,各組織定量使用β-actin作為內(nèi)參基因(β-actin-R: TGTTGGCCTTGGGGTTCAG, β-actin- F: CATCAGGGTGTCATGGTTGG)。20 μL反應(yīng)體系中, SYBR Green PCR Mix 10 μL, 目的基因正反向引物(10 μmol/L) (Asnanos1-F: ATCAGACACGCAAACGG-CTA, Asnanos1-R: AGCCTCTCTCCCACCTGAA-T)各0.5 μL, cDNA模板9 μL。反應(yīng)參數(shù)為: 95℃, 1 min; 95℃ 15 s, 60℃ 10 s, 72℃ 10 s, 40個循環(huán)。采用2–CtΔΔ法計算在不同組織中的表達水平, 基因表達水平由相對表達量的平均值(Mean ± SEM)表示; 利用SPSS 20.0軟件進行顯著性檢驗, P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 Asnanos1基因的克隆與序列分析

采用驗證引物所得到ORF及UTR序列與高通量轉(zhuǎn)錄組測序時所得到ORF及UTR序列完全相符, Asnanos1的cDNA 全長為1 389 bp, 其中, 5′UTR為414 bp, 3′UTR為279 bp, ORF為696 bp。該基因共編碼231個氨基酸。經(jīng)預(yù)測, 蛋白質(zhì)的分子量為25.8 kD, 等電點為9.03。經(jīng)SingaIP的分析, Asnanos1不含信號肽序列(圖1)。

2.2 Asnanos1空間結(jié)構(gòu)模擬

通過SWISS-MODEL 軟件的同源建模, 將Asnanos1蛋白序列與軟件搜索得到的模板進行人工配聯(lián), 構(gòu)建其三維結(jié)構(gòu), 結(jié)果顯示, 該蛋白共含有5個α-螺旋和2個β-折疊(圖2)。

2.3 編碼Asnanos1蛋白序列的多重比對以及系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建

將Asnanos1的氨基酸序列與別的物種的nanos1蛋白進行多重序列比對。結(jié)果表明nanos1基因編碼的蛋白雖然具有較高的保守型, 但編碼的氨基酸的長度卻存在一定差異(圖3A)。另外, 通過Blast分析可知, Asnanos1蛋白與斑點雀鱔的nanos1蛋白相似性最高, 達到了67%。根據(jù)已在NCBI上注冊的nanos基因的氨基酸序列, 采用MEGA 7.0 軟件, 以N-J法構(gòu)建了18 種生物的系統(tǒng)進化樹(圖3B)。N-J 系統(tǒng)進化樹結(jié)果顯示: Asnanos1與nanos2和nanos3在分類進化上的關(guān)系更遠, 而與nanos1聚為一大支。在nanos1的進化中, 施氏鱘與斑點雀鱔聚為一支, 與其他物種的nanos1分開。

2.4 Asnanos1基因在雌、雄施氏鱘不同組織中的表達

圖1 Asnanos1全長cDNA序列及氨基酸序列Fig. 1 cDNA and deduced amino acid sequences of the Asnanos1 gene黃色底為磷酸化位點; 起始密碼子atg用紅色線表示; 終止密碼子taa用加粗表示; 灰色區(qū)域為α螺旋。下劃線所指示的區(qū)域為保守的-CCHC-鋅指結(jié)構(gòu)域, 黑色加粗顯示的為核心的Cys或HisPhosphorylation sites are marked in yellow; The initiation codon(atg) is marked by red line; The stop codon(taa) is characterized in bold; Five α-helixed are marked with gray; Conserved -CCHC- zinc finger domain is underlined; Cys or His are in bold

圖2 推測的Asnanos1氨基酸序列的三級結(jié)構(gòu)Fig. 2 Predicted three-dimensional structure of the Asnanos1 gene

以β-actin為內(nèi)參基因, 實時熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示(圖4), Asnanos1基因在施氏鱘除心臟以外的各組織中均有表達, 在雌、雄魚的鰓、腦、腎、肝臟、脾臟等組織中表達量無顯著差異, 但在卵巢中的表達量顯著高于其他各組織(P＜0.05)。

3 討論與結(jié)論

本研究獲得了Asnanos1的cDNA 全長為1 389 bp,其中, 5′UTR為414 bp, 3′UTR為279 bp以及696 bp的ORF。該基因共編碼231個氨基酸。Blast分析可知, Asnanos1與nanos2和nanos3在分類進化上的關(guān)系較遠, 而與nanos1聚為一大支。這些結(jié)果充分表明本研究所得到的基因序列為Asnanos1。系統(tǒng)進化樹結(jié)果顯示: 在nanos1的進化中, 施氏鱘與斑點雀鱔聚為一支, 但與中華鱘有一定的距離, 產(chǎn)生這個現(xiàn)象的原因有待于進一步研究。

Asnanos1蛋白氨基酸序列的C端具有兩個保守-CCHC-(-Cys-Cys-His-Cys-)鋅指結(jié)構(gòu)域, 這一結(jié)構(gòu)特征與在其他物種nanos1中也同樣存在, 是nanos1蛋白發(fā)揮功能所必需的。

圖3 Asnanos1基因氨基酸序列與其他物種的多重比對及系統(tǒng)進化樹Fig. 3 Multiple alignment and phylogenetic tree analyses of the Asnanos1 amino acid sequence between Acipenser schrenckii and other speciesA. Asnanos1基因氨基酸序列與其他物種的nanos1基因氨基酸序列多重比對。圖中方框內(nèi)為保守的鋅指結(jié)構(gòu)域中的Cys和His; B. 不同物種nanos基因的系統(tǒng)進化樹。多重序列比對和系統(tǒng)進化樹所用物種的Nanos氨基酸序列在GenBank上的登錄號如下: 其中, 人(Homo sapiens): nanos1, NP_955631; nanos2, NP_001025032; nanos3, NP_001092092.1; 小鼠(Mus musculus): nanos1, AAH56473.2; nanos2, NP_918953.2; nanos3, BAC82558.1; 斑馬魚(Danio rerio): nanos1, NP_001292590.1; nanos2, DAA64468.1; nanos3, NP_571953.1; 鳉青(Oryzias latipes): nanos1, ABU63571.1; nanos2, NP_001153919.1; nanos3, NP_001116300.1; 斑點雀鱔(Lepisosteus oculatus): nanos1, XP_006630660.1; 西部錦龜(Chrysemys picta bellii): nanos1, XP_005284212.1; 褐背擬地鴉(Pseudopodoces humilis): nanos1, XP_005520948.1;矛尾魚(Latimeria chalumane): nanos1, XP_005999283.1; 大黃魚(Larimichthys crocea): nanos2, AHN52225.1; nanos3, AHE78415; 尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus): nanos2, XP_005448912.1.中華鱘 (Acipenser sinensis): nanos1, AFD10415.1A. Multiple alignment of the Asnanos1 amino acid sequence between A. schrenckii and other species. Cys and His are conserved. The -CCHC-zinc finger domain is marked with a square. B. Phylogenetic tree of the nanos amino acid sequences between A. schrenckii and other species

圖4 Asnanos1基因在雌雄各組織器官的表達Fig. 4 Distribution pattern of the Asnanos1 gene in different Acipenser schrenckii tissues＊. Asnanos1基因在卵巢中的表達量與其他各組織存在顯著性差異*. Significant difference between ovary and other tissues

在青鳉中, nanos1(nanos1a和nanos1b)在腦中有表達, 且nanos1a存在于精母細胞或卵母細胞周圍的體細胞中, 而性腺組織中未檢測到nanos1b的表達[9];中華鱘nanos1 mRNA在肝臟、脾臟、心臟、卵巢、腎、肌肉、腸、腦垂體、下丘腦、端腦、中腦、延腦等組織中都有表達, 在腦垂體、下丘腦、端腦中表達量最高, 在脂肪組織中沒有表達[12]。本次實時熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示(圖4), Asnanos1基因除心臟以外, 在雌、雄魚的脾、腦、肝、鰓和腎等組織中均有表達, 在卵巢中的表達量顯著高于其他各組織(P＜0.05), 可見nanos1在不同的魚類中表達的模式存在明顯的差異。Asnanos1基因在卵巢中的表達量顯著高于其他各組織, 鳉而青和中華鱘nanos1沒有這種現(xiàn)象, 這是否預(yù)示Asnanos1與施氏鱘性別決定及性別分化有關(guān)？這個問題有待于進一步研究。

總之, 本研究結(jié)果表明Asnanos1的cDNA 全長為1 389 bp, 其中, ORF為696 bp, 5′UTR為414 bp, 3′UTR為279 bp。該基因共編碼231個氨基酸。Asnanos1在施氏鱘精巢和卵巢中表達量存在顯著差異, 本研究所得到的結(jié)果可為人工培育全雌施氏鱘苗種提供一些基礎(chǔ)資料。至于Asnanos1是否與施氏鱘性別決定及性別分化有關(guān)有待進一步研究。

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Sequence and differential expression analyses of the Asnanos1 gene in different tissues of male and female Acipenser schrenckii

XIAO Yi-zhe1, ZHU You-fang1, SUN Yu-long2, ZHANG Xin3, ZHANG Zi-ping3, WANG Yi-lei2
(1. Putian Municipal Institute of Fishery Science, Putian 351100, China; 2. Fisheries College, Jimei University, Xiamen 361021, China; 3. College of Animal Science, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China)

Aug. 1, 2016

Acipenser schrenckii; nanos1; real-time PCR; female and male; gene expression

The full-length cDNA of the Asnanos1 gene was obtained from the gonadal transcriptome of Acipenser schrenckii. The sequence was confirmed by polymerase chain reaction (PCR) and analyzed with a bioinformatics tool. The expression levels of Asnanos1 mRNA in gonad, heart, gill, brain, kidney, and spleen were examined in males and females by quantitative real-time PCR. The results showed that the full-length cDNA was 1 389 bp including a 414 bp 5′-untranslated region (UTR), a 279 bp 3′-UTR, and a 696 bp open reading frame encoding a 231 amino acid. Asnanos1 was expressed in all tissues tested except the heart. The expression levels of the Asnanos1 gene in spleen, brain, liver, gill, and kidney were not significantly different between males and females. The expression level was highest in the ovary among all tissues tested (P ＜ 0.05). Our results provide insight into the development of all-female breeding technology for A. schrenckii.

Q785; S968.3

A

1000-3096(2017)04-0017-07

10.11759//hykx20160801001

(本文編輯: 譚雪靜)

2016-08-01;

2016-10-24

國家自然科學(xué)基金資助項目(41306174); 福建省農(nóng)業(yè)科技重點資助項目(2013N0024); 莆田市科技局項目(2012N16)

[Foundation: The National Natural Science Foundation of China, No. 41306174; Key Project in Agricultural Science and Technology of Fujian Province, No. 2013N0024; Science and Technology Development Project of Putian, No. 2012N16]

肖懿哲(1964-), 男, 福建莆田人, 副研究員, 主要從事水產(chǎn)養(yǎng)殖技術(shù)工作, 電話: 0594-6298821, E-mail: yzxiao@scsio.ac.cn;王藝磊, 通信作者, E-mail: ylwang@jmu.edu.cn