董思圻 李繼安 田春雨 高秀娟 李曉永 程瑞婷 付茜茹 吳 博 周雪梅

(華北理工大學(xué)中醫(yī)學(xué)院2013級碩士研究生，河北 唐山 063000)

實(shí) 驗(yàn) 研 究

十子代平方組方中藥及其主要成分抑制α-葡萄糖苷酶的實(shí)驗(yàn)研究※

董思圻 李繼安 田春雨△高秀娟 李曉永1程瑞婷 付茜茹 吳 博 周雪梅

(華北理工大學(xué)中醫(yī)學(xué)院2013級碩士研究生，河北 唐山 063000)

目的 探究十子代平方的10種組方藥物以及每種藥物的主要成分對α-葡萄糖苷酶活性的影響，明確該方對α-葡萄糖苷酶起抑制作用的主要成分。方法 利用蔗糖為底物的體外α-葡萄糖苷酶篩選模型，以葡萄糖氧化酶法測定10種中藥及主要成分對α-葡萄糖苷酶的抑制率；以阿卡波糖為陽性對照，分別計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組的抑制率和半數(shù)抑制率(IC50)。結(jié)果 10種中藥及10種單體成分均有一定α-葡萄糖苷酶抑制作用。其中，菟絲子、茺蔚子、五味子、萊菔子、紫蘇子5種中藥和迷迭香酸、金絲桃苷、芥子堿硫氰酸鹽3種成分的抑制作用較強(qiáng)，呈明顯的濃度-效應(yīng)關(guān)系。當(dāng)濃度為125 mg/mL時(shí)，紫蘇子、菟絲子、五味子、萊菔子、茺蔚子的抑制率分別為58.49%、55.32%、54.01%、53.13%和50.67%，同濃度阿卡波糖的抑制率為92.09%；當(dāng)濃度為40 mmol/L時(shí)，迷迭香酸、金絲桃苷、芥子堿硫氰酸鹽的抑制率分別為93.52%、87.10%、78.11%，同濃度阿卡波糖的抑制率為90.89%。菟絲子、茺蔚子、五味子、萊菔子、紫蘇子、迷迭香酸、金絲桃苷、芥子堿硫氰酸鹽和阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶抑制作用的IC50分別為44.401、89.608、72.146、82.139、21.549、0.412、0.605、0.860和0.376 mg/mL。結(jié)論 10種中藥及10種單體成分均可一定程度上抑制α-葡萄糖苷酶，中藥菟絲子、茺蔚子、五味子、萊菔子、紫蘇子和單體迷迭香酸、金絲桃苷、芥子堿硫氰酸鹽對α-葡萄糖苷酶的抑制力較強(qiáng)。

糖尿病，2型；中藥；藥物作用；藥理學(xué)；α-葡萄糖苷酶

α-葡萄糖苷酶是機(jī)體糖吸收過程中的關(guān)鍵酶，飲食中的淀粉、麥芽糖、糊精、蔗糖等碳水化合物在α-葡萄糖苷酶的作用下才能水解為葡萄糖被小腸上皮吸收入血[1]。α-葡萄糖苷酶抑制劑可競爭性抑制腸道α-葡萄糖苷酶的活性，使淀粉、麥芽糖等分解為葡萄糖的速度減慢，延緩人體對葡萄糖的吸收，從而有效地降低餐后高血糖、減輕高糖毒性，對糖尿病防治有重要意義。前期實(shí)驗(yàn)“五子降糖方改善2型糖尿病(T2DM)大鼠糖代謝作用的研究”證實(shí)了該方具有補(bǔ)腎化濁的作用，能夠降低2型糖尿病大鼠丙二醛(MDA)、調(diào)節(jié)糖代謝，有較好的抗氧化和糖調(diào)節(jié)作用[2]。故課題組以五子降糖方為基礎(chǔ)，又加入茺蔚子、枸杞子、梔子、五味子、決明子5味中藥，組成復(fù)方“十子代平方”。本研究通過體外實(shí)驗(yàn)，探討十子代平方在α-葡萄糖苷酶抑制方面的作用，明確其發(fā)揮苷酶抑制作用的主要中藥和有效成分，為今后組分中藥的研發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑與儀器 迷迭香酸(批號：20141027)，購于上海金德生物科技有限公司；京尼平苷酸(批號：111828-201102)，大黃酚(批號：110796-201319)，鹽酸水蘇堿(批號：110712-201312)，甜菜堿(批號：110894-200503)，芥子堿硫氰酸鹽(批號：111702-201303)，特女貞苷(批號：111926-201404)，金絲桃苷(批號：111521-201406)，梔子苷(批號：110749-201316)，五味子甲素(批號：110764-201312)，阿卡波糖(批號：100808-201203)，均購于中國食品藥品檢定研究院；α-葡萄糖苷酶(批號：SLBJ8746V)，購于sigma公司；葡萄糖測定試劑盒(批號：143251)，購于中生北控生物科技股份有限公司；車前子、茺蔚子、枸杞子、決明子、萊菔子、女貞子、菟絲子、梔子、紫蘇子、五味子，購于北京同仁堂唐山連鎖藥店，經(jīng)田春雨副教授鑒定。M200PRO酶標(biāo)儀(瑞士TECAN公司)；BS224S電子天平SOP(德國賽多利斯公司)；8685筆型酸堿計(jì)(衡欣科技股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 中藥水提液的制備 萊菔子、菟絲子、車前子、女貞子、茺蔚子、枸杞子、梔子、決明子、紫蘇子、五味子各取20 g加100 mL蒸餾水，室溫浸泡30 min，微火煎煮2次共1 h，合并2次煎煮液過濾濃縮至20 mL，得到10種中藥水提液(相當(dāng)于1 g/mL生藥)，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 α-葡萄糖苷酶體外篩選模型的建立[3]以96孔板為反應(yīng)載體，每個(gè)樣品做2個(gè)副孔。設(shè)定反應(yīng)容積為120 μL。反應(yīng)體系為：加入酶液20 L，磷酸鹽緩沖液(pH=6.8)60 μL，分別加入不同濃度10味中藥、10種成分、阿卡波糖溶液20 μL，37 ℃溫箱反應(yīng)5 min，然后加入20 μL最適濃度的蔗糖溶液為底物，37 ℃反應(yīng)30 min后，加入Na2CO3溶液100 μL終止反應(yīng)。

反應(yīng)生成的葡萄糖，采用葡萄糖氧化酶法測定。提前20 min取出試劑盒，平衡至室溫。試劑盒包括2瓶液體，分別為R1、R2，將二者混勻即為工作液。96孔板中加樣品1 μL，工作液150 μL，混勻后放入37 ℃溫箱，保溫10 min。取出孔板，用酶標(biāo)儀在650(單孔)nm處測定吸光度A，同時(shí)在505(多孔)nm處，測定吸光度B。B-A即得到排除中藥單體顏色的吸光度值(A樣品)。

α-葡萄糖苷酶抑制率計(jì)算公式：抑制率=[(A空白-A樣品)/A空白]×100%。

1.2.3 反應(yīng)體系的優(yōu)化 為了建立α-葡萄糖苷酶抑制作用體外模型最佳反應(yīng)體系，實(shí)驗(yàn)前分別對酶濃度、底物濃度和反應(yīng)時(shí)間按三因素四水平正交設(shè)計(jì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。選定因素和水平見表1。

表1 α-葡萄糖苷酶抑制作用體外模型最佳反應(yīng)體系篩選因素水平表

2 結(jié) 果

2.1 反應(yīng)體系優(yōu)化正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果 見表2。

表2 反應(yīng)體系優(yōu)化正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表2可見，三因素四水平正交實(shí)驗(yàn)得到了優(yōu)化的體外實(shí)驗(yàn)反應(yīng)體系，確定最佳反應(yīng)因素：底物為1 mol/L蔗糖，酶液濃度為1.25 mg/mL，反應(yīng)時(shí)間為40 min。

2.2 10種中藥有效成分和阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶抑制率比較 見表3。

表3 10種中藥有效成分和阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶抑制率比較 ±s

與阿卡波糖組比較，*P<0.05,△P<0.01

由表3可見，隨著濃度的增加，迷迭香酸、金絲桃苷和芥子堿硫氰酸鹽3種成分溶液α-葡萄糖苷酶的抑制作用逐漸增強(qiáng)，有明顯的濃度-效應(yīng)關(guān)系，其中迷迭香酸作用最強(qiáng)，濃度在40 mmol/L(14.41 mg/mL)時(shí)抑制率為93.52%，超過了同濃度下阿卡波糖(25.82 mg/mL)的抑制率90.89%；其次是金絲桃苷，當(dāng)金絲桃苷濃度達(dá)到40 mmol/L(18.57 mg/mL)時(shí)，其對α-葡萄糖苷酶的抑制率已達(dá)87.10%；芥子堿硫氰酸鹽對α-葡萄糖苷酶也顯示出較強(qiáng)的抑制作用，當(dāng)芥子堿硫氰酸鹽濃度達(dá)到40 mmol/L(14.74 mg/mL)時(shí)，抑制率為78.11%，相當(dāng)于濃度10 mmol/L(6.46 mg/mL)阿卡波糖的作用。

2.3 10味中藥水提液對α-葡萄糖苷酶抑制作用的篩選 選擇5 mg/mL和50 mg/mL 2個(gè)濃度對10味中藥的水提液進(jìn)行酶抑制作用的初篩，其中茺蔚子、萊菔子、紫蘇子、五味子、菟絲子5味中藥的抑制作用較強(qiáng)，濃度為50 mg/mL時(shí)抑制率分別為50.79%、50.07%、50.99%、51.34%和50.22%，同濃度陽性對照藥阿卡波糖的抑制率為87.69%，其它樣本的抑制率均在50%以下。根據(jù)初篩結(jié)果，對茺蔚子、萊菔子、紫蘇子、五味子、菟絲子5味中藥開展進(jìn)一步濃度效應(yīng)的測定。實(shí)驗(yàn)顯示：隨著藥液濃度的增加，5味中藥水提液對α-葡萄糖苷酶的抑制作用逐漸增強(qiáng)，呈顯著的濃度-效應(yīng)關(guān)系，當(dāng)濃度為125 mg/mL時(shí)抑制作用由強(qiáng)到弱依次為：紫蘇子>菟絲子>五味子>萊菔子>茺蔚子，抑制率分別為58.49%、55.32%、54.01%、53.13%和50.67%。陽性對照阿卡波糖的α-葡萄糖苷酶抑制作用最強(qiáng)，濃度為125 mg/mL時(shí)抑制率達(dá)92.09%。初篩和復(fù)篩結(jié)果見表4、表5。

表4 十子代平方10種組方中藥水提液和阿卡波糖溶液α-葡萄糖苷酶抑制劑的初篩結(jié)果

表5 5味中藥水提液和阿卡波糖溶液對α-葡萄糖苷酶抑制作用的濃度效應(yīng)

2.4 茺蔚子、萊菔子、蘇子、五味子、菟絲子、迷迭香酸、芥子堿硫氰酸鹽、金絲桃苷和阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶抑制作用的IC50 見表6。

表6 5種中藥及4種成分對α-葡萄糖苷酶抑制作用的IC50 mg/mL

3 討 論

抑制腸道α-葡萄糖苷酶活性是治療2型糖尿病的重要靶向之一，對控制餐后血糖、調(diào)節(jié)糖穩(wěn)態(tài)、降低糖尿病并發(fā)癥具有重要意義[4]。已經(jīng)上市的α-葡萄糖苷酶抑制劑主要有阿卡波糖、伏格列波糖和米格列醇[5]，該類藥物雖然在臨床應(yīng)用中均取得良好療效，但嚴(yán)重的胃腸道反應(yīng)一定程度限制了其使用范圍[6]。2型糖尿病病因病機(jī)繁雜，發(fā)病條件廣泛，單用該類藥物難以解決糖尿病患者整體代謝紊亂的問題[7]。因此，闡釋有效方藥的多靶點(diǎn)作用機(jī)制、明確總方不同作用靶向的活性成分、開發(fā)作用靶向明確的高活性配方中藥已經(jīng)成為中藥現(xiàn)代化的新方向。本研究從治療2型糖尿病的有效復(fù)方“十子代平方”入手，利用蔗糖為底物的α-葡萄糖苷酶體外篩選模型，探求該方發(fā)揮抑制α-葡萄糖苷酶的有效藥物成分。

“十子代平方”由菟絲子、萊菔子、車前子、茺蔚子、枸杞子、決明子、女貞子、梔子、紫蘇子、五味子組成，以菟絲子、萊菔子益腎，化痰，為君；女貞子、枸杞子、五味子固本益精，紫蘇子降氣化痰，為臣；茺蔚子、梔子、決明子、車前子清熱消瘀，通利泄瀉，為佐、使。全方集補(bǔ)腎益精、理氣化痰、清熱活血于一體，能夠促進(jìn)機(jī)體糖代謝，明顯降低空腹、餐后、隨機(jī)血糖及糖化血紅蛋白水平。

近期研究表明，五味子、枸杞子、梔子、女貞子、決明子等中藥能夠抑制腸道α-葡萄糖苷酶活性，阻斷碳水化合物分解為葡萄糖，控制餐后血糖的升高[8-13]；菟絲子多糖、齊墩果酸等生物單體對人體的糖脂代謝有一定改善作用[14-15]。本實(shí)驗(yàn)以α-葡萄糖苷酶為作用靶點(diǎn)，建立體外α-葡萄糖苷酶活性抑制作用篩選模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)10味中藥以及10種單體成分(車前子—京尼平苷酸；茺蔚子—鹽酸水蘇堿；枸杞子—甜菜堿；決明子—大黃酚；萊菔子—芥子堿硫氰酸鹽；女貞子—特女貞苷；菟絲子—金絲桃苷；梔子—梔子苷；紫蘇子—迷迭香酸；五味子—五味子甲素)對α-葡萄糖苷酶均有一定抑制作用，菟絲子、茺蔚子、五味子、萊菔子、紫蘇子5種中藥和迷迭香酸、金絲桃苷、芥子堿硫氰酸鹽3種成分的抑制作用較強(qiáng)，當(dāng)濃度為125 mg/mL時(shí)，菟絲子、茺蔚子、五味子、萊菔子、紫蘇子的抑制率分別為55.32%、50.67%、54.01%、53.13%、58.49%，同濃度阿卡波糖的抑制率為87.69%，當(dāng)濃度為40 mmol/L時(shí)，迷迭香酸、金絲桃苷、芥子堿硫氰酸鹽的抑制率分別為93.52%、87.10%、78.11%，與同濃度阿卡波糖90.89%的抑制作用相近，且呈明顯的濃度-抑制效應(yīng)關(guān)系。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，十子代平方10味組方中藥能夠抑制α-葡萄糖苷酶活性，菟絲子、茺蔚子、五味子、萊菔子、紫蘇子是抑制該酶活性的主要中藥，迷迭香酸、金絲桃苷、芥子堿硫氰酸鹽是該方發(fā)揮降糖作用的主要有效成分。本實(shí)驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)芥子堿硫氰酸鹽具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的作用，為中藥萊菔子降糖作用的進(jìn)一步研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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(本文編輯：董軍杰)

Experimental Study on the inhibitory effects of Shizi daiping Formula and its main ingredients on α-glucosidase

DONG Siqi*, LI Ji'an, TIAN Chunyu,et al.

*2013-Grade Master of College of Traditional Chinese Medicine Affiliated to North China University of Science and Technology, Hebei, Tangshan 063000

Objective To explore and study the effects of 10 kinds of Chinese herbs of Shizi daiping formula and their main ingredients on the activity of α-glucosidase, and definite the main ingredient of inhibitory effect on α-glucosidase. Methods Sucrose as a substrate was used to develop an in vitro screening model of α-glucosidase, the inhibition rate of 10 kinds of Chinese herbs and their main ingredients on α-glucosidase was detected by glucose oxidase method. Acarbose was used as the positive control, and the inhibition rate and IC50 in each experimental group were calculated. Results 10 kinds of Chinese herbs and 10 kinds of monomer ingredients have a certain inhibitory effect on α-glucosidase. 5 kinds of Chinese herbs were dodder, fructus leonuri, schisandra, semen raphani, perillaseed and 3 kinds of ingredients were rosmarinic acid, hyperin, sinapine thiocyanate, which had stronger inhibitory effect on α-glucosidase and showed a significant relationship of concentration-effect. When concentration was 125 mg/mL, the inhibition rates of perillaseed, dodder, schisandra, semen raphani, fructus leonuri were 58.49%, 55.32%, 54.01%, 53.13% and 50.67% respectively, and the acarbose was 92.09%. When concentration was 40 mmol/L, the inhibition rates of rosmarinic acid, hyperin and sinapine thiocyanate were 93.52%, 87.10%, 78.11% respectively, and the acarbose was 90.89%. The IC50 of the inhibitory effect of dodder, fructus leonuri, schisandra, semen raphani, perillaseed, rosmarinic acid, hyperin, sinapine thiocyanate and acarbose on α-glucosidase were 44.401 mg/mL, 89.608 mg/mL, 72.146 mg/mL, 82.139 mg/mL, 21.549 mg/mL, 0.412 mg/mL, 0.605 mg/mL, 0.860 mg/mL and 0.376 mg/mL respectively. Conclusion 10 kinds of Chinese herbs and 10 kinds of monomer ingredients have inhibitory effect on α-glucosidase in a certain extent. The Chinese herbs of dodder, fructus leonuri, schisandra, semen raphani, perillaseed and the monomers of rosmarinic acid, hyperin, sinapine thiocyanate have stronger inhibitory effect on α-glucosidase.

Diabetes, type 2; Traditional Chinese medicine; Drug action; Pharmacological; α-glucosidase

10.3969/j.issn.1002-2619.2017.06.018

※ 項(xiàng)目來源：河北省科技計(jì)劃項(xiàng)目(編號：13392502D)；河北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(編號：H2015209025)；河北省高等學(xué)?？茖W(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(編號：QN2015119)

董思圻(1987—)，女，碩士研究生在讀。從事中醫(yī)糖脂代謝疾病研究工作。

R345.62;R345;R977.3；R587.1

A

1002-2619(2017)06-0875-05

2017-04-01)

△ 通訊作者：華北理工大學(xué)中醫(yī)學(xué)院中藥學(xué)教研室，河北 唐山 063000

1 河北省唐山市傳染病醫(yī)院傳染科，河北 唐山 063000