徐曉宇，石秀錦，續(xù)茜橋，彭文星，林 陽

（首都醫(yī)科大學附屬北京安貞醫(yī)院藥劑科，北京 100029）

年齡與性別對氯吡格雷抗血小板療效與PON1 Q192R基因多態(tài)性相關(guān)性的影響

徐曉宇，石秀錦，續(xù)茜橋，彭文星，林 陽

（首都醫(yī)科大學附屬北京安貞醫(yī)院藥劑科，北京 100029）

目的：本研究回顧性分析了年齡和性別對PON1 Q192R基因多態(tài)性與氯吡格雷抗血小板療效之間相關(guān)性的影響。方法：收集1254例納入研究的患者連續(xù)服用標準雙抗≥3天后測得的血小板聚集率（PAR），將PAR ＞ 50%定義為氯吡格雷抵抗（CR）。比較不同年齡組及不同性別的人群中PON1 Q192R基因型與CR的相關(guān)性。結(jié)果：本研究人群PON1 Q192R最小等位基因頻率（minor allele frequency，MAF）為37%。在整體人群中，PON1 Q192R突變純合型（A/A）患者中CR發(fā)生率（59.39%）與野生型（G/G）患者（43.58%）及突變雜合型（G/A）患者（49.00%）中CR發(fā)生率相比具有顯著差異（P2 ＜ 0.001，P3 = 0.02）。在≤65歲的患者中，G/G型患者的CR發(fā)生率（41.69%）與A/A型（57.58%）相比有顯著性差異（P2 ＜ 0.001），而在＞ 65歲的老年患者中，不同基因型CR發(fā)生率雖有不同，但差異無統(tǒng)計學意義（P1，P2，P3 ＞ 0.05）。男性患者中CR發(fā)生率（45.87%）顯著低于女性（53.91%，P = 0.01）。同時，在男性患者中，G/G型患者CR的發(fā)生率（40.63%）與A/A型（57.02%）相比有顯著性差異（P2 ＜ 0.001），而在女性患者中，不同基因型的患者間，CR發(fā)生率無明顯差異（P1，P2，P3 ＞ 0.05）。結(jié)論：高齡和女性作為CR的獨立危險因素，會削弱PON1 Q192R基因多態(tài)性造成的個體間氯吡格雷抗血小板療效的差異。

氯吡格雷；PON1 Q192R；年齡；性別

氯吡格雷作為經(jīng)典的吩噻吡啶類抗血小板藥，廣泛應用于經(jīng)皮冠狀動脈介入術(shù)（PCI）術(shù)后患者的抗血小板治療。作為一種前體藥物，氯吡格雷在體內(nèi)經(jīng)過兩步活化才能發(fā)揮抗血小板作用，其活化過程中所需酶的活性降低可能會減弱其抗血小板療效，進而導致出血或支架內(nèi)血栓等不良事件。自Bouman等[1]報道對氧磷酶-1（PON-1）可能是氯吡格雷體內(nèi)第二步活化過程中的關(guān)鍵酶，近期Chen等[2]的研究結(jié)果顯示PON1 Q192R基因多態(tài)性與氯吡格雷抗血小板療效及遠期不良心血管事件相關(guān)。但目前國內(nèi)外研究結(jié)果并不一致[2-10]。各項研究的研究人群的人種、數(shù)量、年齡及性別分布以及研究的評價指標不同可能是造成研究結(jié)果不一致的原因之一。

氯吡格雷通過抑制二磷酸腺苷（ADP）受體發(fā)揮作用，其抗血小板療效的發(fā)揮不僅受遺傳因素的影響，此外還可能與年齡、性別、合并癥及合并用藥相關(guān)。本研究從遺傳學角度對年齡與性別對CR與PON1 Q192R基因多態(tài)性之間相關(guān)性的影響進行初步評價，尋找進行氯吡格雷相關(guān)基因檢測獲益更大的群體，以期給臨床提供參考，節(jié)約醫(yī)療成本。

1 資料與方法

1.1 研究人群

回顧性收集2007年11月– 2016年3月在安貞醫(yī)院行PCI手術(shù)，并進PON1 Q192R基因多態(tài)性檢測的患者7793例，通過本研究的納入排除標準，最終共篩選出1254例患者。

納入標準：①明確手術(shù)記錄行PCI的患者；②入院后接受阿司匹林100 mg·d-1和氯吡格雷75 mg·d-1標準雙抗≥3天后[11]進行血小板聚集率（platelet aggregation rate，PAR）檢查；或出院后門診記錄為在我院門診規(guī)律處方標準劑量阿司匹林和氯吡格雷，其血小板聚集率檢測時間在其處方量時間范圍內(nèi)。

排除標準：①嚴重腎功能不全（Cr ＜ 30 mL·min-1）；②合并出血性疾病；③合并使用華法林、雙嘧達莫或其他新型口服抗凝藥（如：達比加群酯、利伐沙班等）；④血小板聚集率檢測前3天內(nèi)更改藥物劑量或漏服；⑤血小板計數(shù)＜ 100×109·L-1。

1.2 血小板聚集率檢測

患者規(guī)律服用標準雙抗≥3 d，于晨起服藥2.5 h后，用含3.8%枸櫞酸鈉抗凝管采集肘靜脈血，充分混勻。先將試管在4000 ～ 5000 r·min-1條件下離心5 min，獲得富含血小板的血漿（PRP），然后吸取PRP后剩余的血樣經(jīng)22 500 r·min-1高速離心15 min獲取貧血小板血漿（PPP）。把PPP和PRP混合，將血小板濃度稀釋至2×105μmol·L-1，加入6 μmol·L-1的ADP誘導血小板聚集，之后測定血小板聚集率，儀器使用的是Chrono-Log Lune Aggregometer（model 700，美國）。根據(jù)Barragan等[12]人的研究，將PAR ＞ 50%定義為氯吡格雷抵抗。

1.3 SNP檢測與分型

用EDTA（乙二胺四乙酸）抗凝管采血2 ～ 3 mL，采用熒光染色原位雜交檢測法。取150 μL血加入1 mL紅細胞裂解液，靜置5 min后，3000 r·min-1離心5 min，棄上清液，再加入核酸純化試劑（北京華夏時代基因科技發(fā)展有限公司），混勻后加入相應的測序反應通用試劑（北京華夏時代基因科技發(fā)展有限公司），采用雙通道實時熒光定量PCR儀（TL988A，西安天隆科技有限公司）進行檢測。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS20.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理及分析。正態(tài)性連續(xù)性變量采用（均值±標準差）表示，計數(shù)資料用百分比表示。正態(tài)性連續(xù)性變量采用雙側(cè)t檢驗比較兩組之間的差異，計量資料采用卡方檢驗或者Fisher精確檢驗，以P ＜ 0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 基本資料

本研究共納入1254例PCI術(shù)后患者，其中男性883例，女性371例。根據(jù)PAR結(jié)果將患者分為氯吡格雷抵抗組（CR組）和氯吡格雷非抵抗組（NCR組），兩組患者的BMI、腎功能、合并癥（糖尿病、高脂血癥）及合并用藥（β受體阻滯劑、他汀、質(zhì)子泵抑制劑及ACEI/ARB）等基本臨床信息無顯著性差異（P ＞0.05），見表1。

表1 CR組與NCR組患者的基本信息Tab 1 The clinical information of CR and NCR groups

2.2 PON1 Q192R各基因型分布頻率及等位基因頻率

對1254例患者的PON1 Q192R基因型進行統(tǒng)計，其中野生型（G/G）的分布頻率為39.15%，突變雜合型（A/G）的分布頻率為47.69%，而突變純合型（A/A）為13.16%。該研究人群中PON1 Q192R的最小等位基因頻率（minor allele frequency，MAF）為37%（見表2），國際千人基因組計劃（1000 genomes project）中北京漢人PON1 Q192R的MAF為41%，兩者接近，統(tǒng)計學比較無顯著性差異（P = 0.56）。

表2 PON1 Q192R基因型頻率及等位基因頻率Tab 2 The gene frequencies of PON1 Q192R

2.3 不同年齡段患者CR發(fā)生率與PON1 Q192R基因型的關(guān)系

在該研究的總體人群中有605例CR患者，占研究人群總體的48.25%。根據(jù)PON1 Q192R基因型將患者分為3組，分別為G/G組、G/A組和A/A組，CR的發(fā)生率分別為43.58%，49.00%和59.39%，組間比較結(jié)果顯示G/G組與G/A組的CR發(fā)生率無顯著性差異（P = 0.08，P ＞ 0.05），而A/A組發(fā)生CR的概率明顯高于G/G組和G/A組（P2 = 0.00，P3 = 0.02，結(jié)果見表3）。

根據(jù)國際規(guī)定，＞ 65歲為老年人，有文獻報道[13-14]，高齡也是發(fā)生氯吡格雷抵抗的危險因素之一。因此本研究將研究人群按照年齡分為≤65歲組和＞ 65歲組。＞ 65歲組的CR發(fā)生率略高于≤65歲組（51.76% vs 47.03%，P = 0.53 ＞ 0.05）。在≤65歲組各基因型患者中，CR的發(fā)生率分別為41.69%，48.42%和57.58%，組間比較結(jié)果顯示，在≤65歲人群中，A/A組與G/G組CR的發(fā)生率有顯著性差異（P = 0.00 ＜ 0.01）。而在＞ 65歲組中各基因型患者CR的發(fā)生率分別為49.19%，50.64%和66.67%，組間比較均無顯著性差異（P ＞ 0.05）。PON1 Q192R基因多態(tài)性造成的個體間氯吡格雷療效差異在≤65歲的人群中更顯著，在＞ 65歲的患者中該差異明顯減小。

表3 不同年齡段患者的CR發(fā)生率與PON1 Q192R基因型的關(guān)系Tab 3 The relationship between PON1 Q192R genetypes and CR in different ages

2.4 性別對PON1 Q192R基因多態(tài)性與CR發(fā)生率之間相關(guān)性的影響

既往研究結(jié)果顯示[14-17]，女性是氯吡格雷抵抗的一個獨立危險因素。對本研究人群中，CR發(fā)生率在女性患者中為53.91%，明顯高于男性患者（45.87%），差異有統(tǒng)計學意義（P = 0.01，見表4）。

將研究人群分為男、女兩組，分別比較兩組患者中PON1 Q192R基因多態(tài)性與CR之間的相關(guān)性。研究發(fā)現(xiàn)，在男性患者中，CR在不同PON1 Q192R基因型中的發(fā)生率分別為40.63%，47.07%和57.02%，A/A組與G/G組CR的發(fā)生率有顯著性差異（P = 0.00）。而在女性患者中，CR在不同基因組中的發(fā)生率分別為51.08%，53.19%和65.91%，組間比較均無顯著性差異（P ＞ 0.05）。同時相同基因組的患者，女性患者CR的發(fā)生率均高于男性（見表4）。

表4 不同性別患者的CR發(fā)生率與PON1 Q192R基因型的關(guān)系Tab 4 The relationship between PON1 Q192R genetypes and CR in different gender

3 討論

本研究根據(jù)患者服藥后的PAR來評價氯吡格雷的抗血小板療效，Barragan等[12]將PAR ＞ 50%界定為血小板高反應性，即氯吡格雷抵抗（clopidogrel resistance，CR）。本研究的數(shù)據(jù)處理結(jié)果顯示，經(jīng)規(guī)律標準雙抗治療后，個體間PAR差異較大，最大值為96%，而最小值僅為2%，在研究總體中CR的發(fā)生率高達48.25%。

根據(jù)患者PAR將患者分為CR組與NCR組，兩組患者的臨床基本情況無顯著性差異（P ＞ 0.05）。

3.1 在研究總體中PON1 Q192R基因多態(tài)性與氯吡格雷抵抗的相關(guān)性

收集患者PON1 Q192R基因檢測結(jié)果，對患者的PON1 Q192R基因型進行統(tǒng)計分析，結(jié)果顯示，該研究人群的MAF與國際千人基因組計劃中中國人群的MAF相近，差異無統(tǒng)計學意義。說明該研究人群基本可以代表中國人群。

在研究的總體人群中，PON1 Q192R基因多態(tài)性與CR的發(fā)生具有明顯的相關(guān)性，CR的發(fā)生率在G/G組的患者中最低（43.58%），在G/A組和A/A組患者中CR的發(fā)生率逐漸升高（49.00%和59.39%）。且A/A組CR的發(fā)生率與G/G組和G/A組比較有顯著性差異。因此，在整體人群中，PON1 Q192R基因突變可使患者的CR發(fā)生風險增加。

3.2 不同年齡組患者中PON1 Q192R基因多態(tài)性與氯吡格雷抵抗的相關(guān)性

根據(jù)國際老年人劃分標準，將本研究人群根據(jù)年齡分為≤65歲和＞ 65歲兩組，兩組CR發(fā)生率相近（47.03% vs 51.76%），雖＞ 65歲組的CR發(fā)生率較≤65歲組高，但無統(tǒng)計學差異。分別研究不同年齡段的患者中PON1 Q192R基因型與CR發(fā)生率的關(guān)系，結(jié)果顯示，在≤65歲的患者中，PON1 Q192R基因型與CR具有明顯的相關(guān)性，但在＞ 65歲的患者中PON1 Q192R與CR相關(guān)性減弱，雖然攜帶突變基因的患者中CR的發(fā)生率依然大于未攜帶突變基因的患者，但是組間比較無統(tǒng)計學意義。同時，具有相同基因型的患者，＞ 65歲患者CR的發(fā)生率明顯高于≤65歲的患者。因此，高齡是氯吡格雷抵抗的一個危險因素，可以削弱PON1 Q192R與氯吡格雷抵抗之間的相關(guān)性。

3.3 不同性別的研究人群中PON1 Q192R基因多態(tài)性與氯吡格雷抵抗的相關(guān)性

最后，分別對男性和女性患者中，PON1 Q192R基因多態(tài)性與CR的相關(guān)性進行研究，結(jié)果顯示在男性患者的CR發(fā)生率為45.87%，顯著低于女性患者（53.91%）。因此女性可能是CR發(fā)生的一個獨立危險因素。在男性患者中PON1 Q192R基因多態(tài)性與氯吡格雷療效具有明顯相關(guān)性，組間差異有統(tǒng)計學意義。然而在女性患者中，雖然PON1 Q192R基因突變也會增加CR的發(fā)生率，但是組間比較無統(tǒng)計學差異。作為CR的一個獨立危險因素，女性患者中PON1 Q192R基因多態(tài)性造成的氯吡格雷抗血小板療效的個體間差異會被削弱。

綜上所述，高齡和女性作為氯吡格雷抵抗的危險因素，會削弱PON1 Q192R基因多態(tài)性造成的個體間氯吡格雷療效的差異，使CR與PON1 Q192R基因多態(tài)性的相關(guān)性降低。因此，在≤65歲的男性患者中進行PON1 Q192R基因檢測會更有意義。同時該研究結(jié)果也提醒廣大臨床醫(yī)生及藥師，即使患者PON1 Q192R基因型檢測顯示為正常代謝型（野生純合型），也不能判斷患者一定不存在氯吡格雷抵抗現(xiàn)象，需考慮高齡、性別等其他可能造成氯吡格雷抗血小板治療低效甚至無效的因素。

本研究為回顧性研究，且僅通過實驗室指標對氯吡格雷抗血小板療效進行評價，未收集心血管不良事件等臨床終點事件對氯吡格雷的臨床療效進行評價。因此，相關(guān)大樣本前瞻性的研究仍需進一步進行。

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The inf l uence of age and gender on the association between the genetic polymorphism of PON1 Q192R and the effect of clopidogrel

XU Xiao-yu, SHI Xiu-jin, XU Xi-qiao, PENG Wen-xing, LIN Yang
(Department of Pharmacy, Beijing Anzhen Hospital, Beijing 100029, China)

Objective: To investigate the association between the gene polymorphism of PON1 Q192R and the occurrence of clopidogrel resistance (CR) among different age groups and gender groups. Methods: A total of 1254 patients were enrolled. Detailed clinical information and genetypes of PON1 Q192R of each patient was collected. Platelet reactivity was measured with platelet aggregation rate (PAR) which was detected when continuously taking standard antiplatelet drugs more than 3 days. PAR ＞50% was def i ned as CR. The patients were divided into different grous based on their age and gender. Then the correlation of CR and PON1 Q192R in different groups was analyzed. Results: The minor allele frequency (MAF) in our study population was 37%. In PON1 Q192R mutant homozygous type (A/A) group, the rate of CR was 59.39%, which was signif i cantly higher than that of wildtype (G/G) group (43.58%) and mutant heterozygous type (G/A) group (49.00%) (P2 ＜ 0.01, P3 = 0.02 ＜ 0.05). In patients younger than or equal to 65 years old, the rate of CR in G/G group (41.69%) was signif i cantly different from that in A/A group (57.58%) (P2 = 0.00), while there was no signif i cant difference in the rate of CR among patients older than 65 years old (P1, P2, P3 ＞ 0.05). The rate of CR in male patients (45.87%) was signif i cantly lower than that in female patients (53.91%, P2 = 0.01). Moreover, in male patients, the rate of CR in G/G group (40.63%) was signif i cantly different from that in A/A group (57.02%, P2 ＜ 0.001), while there was no signif i cant difference in the rate of CR among female patients with different PON1 Q192R mutant type (P1, P2, P3 ＞ 0.05). Conclusion: Advanced age and femininity might be the independent risk factors of CR, which could weaken the inf l uence of PON1 Q192R on individual differences of clopidogrel treatment. The correlation of PON1 Q192R and CR was much more signif i cant in male patients younger than 65 years old.

Clopidogrel; PON1 Q192R; Age; Gender

R969.4

A

1672 – 8157(2017)03 – 0146 – 05

2017-02-09

2017-03-08）

“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項課題（2012ZX09303016）

林陽，女，主任藥師，研究方向：心血管藥物的個體化治療。E-mail：linyang3623@163.com

徐曉宇，女，碩士研究生，研究方向：臨床藥物基因組學。E-mail：xuxiaoyu1015@sina.com