孫虎+沈崢+鄭玲燕+龔杰

[摘要] 目的 探討同源基因A-13（homeotic genes-A13，HOXA13）和神經(jīng)叢素-B2（Plexin-B2）在腦膠質(zhì)瘤中的表達情況及生物學(xué)意義。 方法 收集2014 年5月～2016年2月間我院診斷的腦膠質(zhì)瘤患者60例，使用 qRT-PCR技術(shù)分別檢測實驗組（腦膠質(zhì)瘤患者）和對照組（健康受試者）血清中S100、HOXA13和Plexin-B2的表達水平，并分析HOXA13和Plexin-B2在不同級別腦膠質(zhì)瘤患者中的表達情況，分析其與腫瘤惡性程度的關(guān)系。 結(jié)果 與對照組對比，實驗組的HOXA13和Plexin-B2在腦脊液及血漿中表達水平顯著升高[血液中：HOXA13，（1.21±0.14） vs 0；Plexin-B2：（1.57±0.33） vs 0；腦脊液中：Plexin-B2：（4.87±1.13） vs 0；Plexin-B2：（5.88±0.21） vs 0]，腫瘤體積越大、分化程度越低，血液中HOXA13和Plexin-B2表達水平越高；腦脊液中HOXA13和Plexin-B2蛋白水平明顯高于血漿中。 結(jié)論 腦膠質(zhì)瘤患者中HOXA13和Plexin-B2表達上調(diào)，且與腫瘤惡性程度有顯著關(guān)系，腦脊液中HOXA13和Plexin-B2表達顯著升高，可用作腦膠質(zhì)瘤惡性程度的標志物。

[關(guān)鍵詞] 腦膠質(zhì)瘤；同源基因A-13；神經(jīng)叢素-B2；qRT-PCR

[中圖分類號] R739.41 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2017）15-0023-04

[Abstract] Objective To investigate the expression and biological significance of gomeotic genes-A13（HOXA13） and neuronal-B2（Plexin-B2） in gliomas. Methods 60 patients diagnosed with glioma were diagnosed in our hospital from May 2014 to February 2016 were chosen. The serum expression levels of S100， HOXA13 and Plexin-B2 in the experimental group（glioma patients） and the control group（health volunteers） were measured by qRT-PCR. And the expression of HOXA13 and Plexin-B2 in different stages of glioma patients was analyzed， the relationship with the degree of tumor malignancy was analyzed. Results Compared with those of the control group， the expression levels of HOXA13 and Plexin-B2 in cerebrospinal fluid and plasma were significantly higher[blood： HOXA，13，（1.21±0.14） vs 0； Plexin-B2， （1.57±0.33） vs 0； cerebrospinal fluid： Plexin-B2， （4.87±1.13） vs 0； Plexin-B2， （5.88±0.21） vs 0]. The larger the tumor volume， the lower the degree of differentiation and the higher the expression level of HOXA13 and Plexin-B2 in the blood. The levels of HOXA13 and Plexin-B2 protein in cerebrospinal fluid were significantly higher than those in plasma. Conclusion The expression of HOXA13 and Plexin-B2 in brain glioma patients is up-regulated and is significantly correlated with the degree of malignancy. The expression of HOXA13 and Plexin-B2 in cerebrospinal fluid is significantly increased and can be used as a marker of malignant degree of glioma.

[Key words] Glioma； HOXA13； Plexin-B2； qRT-PCR

腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤是腦腫瘤中最常見的惡性腫瘤，是嚴重危害人類健康的惡性腫瘤之一。全國腫瘤防治辦公室最近發(fā)表的統(tǒng)計結(jié)果，腦腫瘤調(diào)整死亡率列為第十位主要的惡性腫瘤，在大城市的發(fā)病率男性女性均為第十位[1，2]，因此尋找特征性生物標記物用來診斷腦膠質(zhì)瘤至關(guān)重要。本研究通過檢測血漿及腦脊液中HOXA13和Plexin-B2蛋白的表達，探討HOXA13和Plexin-B2在腦膠質(zhì)瘤的生物學(xué)意義，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 一般資料

收集從2014 年5月～2016 年2 月在我院神經(jīng)外科接受治療的腦膠質(zhì)瘤患者60例（實驗組），30例健康受試者（對照組），所有患者均通過病理診斷證實。入選標準：病理診斷明確，患者知情同意。排除標準：合并其他嚴重并發(fā)癥影響實驗過程；嚴重肝腎功能損害；妊娠及哺乳期婦女。根據(jù)2014年中國腦膠質(zhì)瘤分子診療指南分級，其中腦膠質(zhì)瘤Ⅰ～Ⅱ級30例，腦膠質(zhì)瘤Ⅲ～Ⅳ級30例?；颊咭话闱闆r比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。見表1。已告知患者實驗內(nèi)容和實驗?zāi)康?，并簽署知情同意書?

1.2 總RNA提取

PCR引物采用Primer 5.2設(shè)計S100：Forward Primer：AAGGATGCCGTGGATAAATTGC；Reverse Pri-mer：ACACGATGAACTCACTGAAGTC；HOXA13：For-ward Primer：CTCCCGCGCTAAGGAGTTC；Reverse Pri-mer：CCGGCACCACTGGCATATC；Plexin-B2：Forward Primer：ATGCCAACTCCCTCTCCTG；Reverse Primer：CTAGGCGTATT TCCACGATGC。所有引物由上海生物工程公司合成。收集不抗凝血液3～5 mL，保存4℃冰箱中，在恒溫離心機中，以4℃、3500 r離心10 min，收集上層血清，以200 uL/管分管編號凍存-80℃冰箱中。總RNA提取試劑盒由百泰克公司提供。RT-PCR試劑盒為日本Takara公司生產(chǎn)。按照總RNA提取試劑盒提取所有患者血漿及腦脊液中的總RNA，根據(jù)RT盒的說明書操作，以O(shè)LIGO進行cDNA 的合成。

1.3 qRT-PCR

基因表達用SYBR GREEN I熒光定量PCR在iQTM5上進行監(jiān)測，結(jié)果用該儀器進行分析。結(jié)果重復(fù)3次。反轉(zhuǎn)錄條件：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，40個循環(huán)。

1.4 觀察指標

實驗組和對照組血漿及腦脊液中S100、HOXA13和Plexin-B2的表達差異；不同級別膠質(zhì)瘤S100、HOXA13和Plexin-B2蛋白的表達差異。若患者血漿及腦脊液中分別能夠檢測出S100、HOXA13和Plexin-B2蛋白，則記為該項蛋白表達陽性；反之，記為陰性。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS13.0統(tǒng)計學(xué)軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以（x±s）表示，采用t檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1兩組受試者血漿及腦脊液中S100、HOXA13和Plexin-B2的表達情況

健康受試者血漿中S100表達高于腦膠質(zhì)瘤患者[（6.98±0.23） vs （1.01±0.19），t=1.908，P<0.05]，未檢測出HOXA13和Plexin-B2。而腦膠質(zhì)瘤患者中HOXA13和Plexin-B2基因表達水平增加，無論是血漿[HOXA13：（1.21±0.14）；Plexin-B2：（1.57±0.33）]還是腦脊液[Plexin-B2：（4.87±1.13）；Plexin-B2：（5.88±0.21）]中均明顯上調(diào)。腦脊液中兩者表達水平高于血漿中（t=2.571，P<0.01）。見圖1。

2.2 兩組S100蛋白的表達情況

在健康受試者血清及腦脊液中均可以檢測出S100蛋白。腦膠質(zhì)瘤患者隨惡性程度升高，S100蛋白陽性率患者逐漸減少（χ2=1.773，P<0.05），見表2。

2.3 實驗組中不同級別膠質(zhì)瘤患者HOXA13蛋白的表達情況

在健康受試者血清及腦脊液中不表達HOXA13蛋白。腦膠質(zhì)瘤患者表達HOXA13蛋白，且隨惡性程度升高，HOXA13蛋白陽性率患者逐漸增加（P<0.05）。見表3。

2.4 實驗組中不同級別膠質(zhì)瘤患者Plexin-B2蛋白的表達情況

在健康患者血清及腦脊液中Plexin-B2蛋白基本不表達。腦膠質(zhì)瘤患者Plexin-B2蛋白的表達顯著升高，且隨惡性程度升高，Plexin-B2蛋白陽性率患者逐漸增加（χ2=3.112，P<0.05）。見表4。

3 討論

腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤是腦腫瘤中最常見的惡性腫瘤，嚴重危害人類健康，發(fā)病率仍然居高不下，因此做好腦膠質(zhì)瘤的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷至關(guān)重要。膠質(zhì)瘤是腫瘤形成的異質(zhì)組這占大多數(shù)原發(fā)性腫瘤中樞神經(jīng)系統(tǒng)；盡管由輻射和化療后手術(shù)切除組合治療取得進展，預(yù)后良好的患者療效仍然令人沮喪，與診斷后的中位數(shù)存活約15個月[3-4]。因此，有必要進行識別對膠質(zhì)瘤階段特異的新型生物標志物。盡管近年來隨著影像學(xué)的發(fā)展，膠質(zhì)瘤的診斷、治療有了長足的進展，但其總體療效并無明顯改善，手術(shù)后5年生存率仍在6%左右[5-6]。

S100蛋白是一個酸性的Ca2+結(jié)合蛋白家族，參與細胞內(nèi)和細胞外的因子調(diào)節(jié)，鈣離子對S100蛋白發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)至關(guān)重要[7]。S100蛋白參與許多細胞內(nèi)外功能，如調(diào)節(jié)細胞內(nèi)環(huán)境Ca2+穩(wěn)態(tài)、細胞增殖與凋亡、細胞侵襲、蛋白磷酸化、細胞支架構(gòu)成、自身免疫和炎癥[8]。研究表明S100蛋白與腫瘤增殖呈現(xiàn)負相關(guān)關(guān)系[9]。本實驗結(jié)果表明，患者病變越嚴重，病理級別越高，S100蛋白越少，提示S100蛋白的較少或者沉默，S100蛋白的表達可能為治療膠質(zhì)瘤提供依據(jù)。

HOXA13首先在果蠅中發(fā)現(xiàn)，具有特征存在可識別的183個堿基對的DNA序列，其編碼高度保守的61個氨基酸肽稱為同源結(jié)構(gòu)域[10-11]。HOXA13位于HOXA的5'端位點。最近的研究表明涉及HOXA13在癌發(fā)生和促進腫瘤生長。有些報道顯示[12-13]異常HOXA13表達與肝細胞癌有關(guān)和HOXA13過表達提示肝癌患者易轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后。實驗數(shù)據(jù)顯示HOXA13基因與腫瘤惡性程度相關(guān)，惡性程度越高，該基因表達越高。研究表明HOX家族基因與腫瘤級別相關(guān)，且在膠質(zhì)瘤中預(yù)示著預(yù)后不良[14]。HOXA13抑制膠質(zhì)瘤細胞生長細胞系和異種移植模型[15]。

神經(jīng)叢素B2（Plexin-B2）是一種跨膜受體，其參與響應(yīng)于信號素的軸突引導(dǎo)和細胞遷移，參與腫瘤細胞侵襲和血管生成研究顯示，膠質(zhì)瘤患者的中位生存期不到2年，且預(yù)后不良，生活質(zhì)量差[16-17]。Plexin-B2在膠質(zhì)瘤生長和侵襲中發(fā)揮關(guān)鍵作用[18]。此外，近來對膠質(zhì)瘤患者樣品的分析鑒定了Plexin-B2作為高級膠質(zhì)瘤的潛在生物標志物[19]。此外，既往研究已經(jīng)建立Plexin-B2作為遷移的胚胎和成人神經(jīng)前體細胞的重要調(diào)節(jié)器[20]。研究顯示，Plexin-B2表達在人膠質(zhì)瘤中上調(diào)，其表達水平與膠質(zhì)瘤級別相關(guān)，機制可能為Plexin-B2激活改變肌動蛋白細胞骨架和促進膠質(zhì)瘤細胞的遷移[21]。

綜上所述，HOXA13和Plexin-B2可能是一種新型診斷和預(yù)測腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的標志物，作為潛在的預(yù)后生物標志物和高級別膠質(zhì)瘤的新藥物靶標的作用。

[參考文獻]

[1] 李連弟，魯鳳珠，張思維，等. 中國惡性腫瘤死亡率20年變化趨勢和近期預(yù)測分析[J].中華腫瘤雜志，1997， 19（1）：3-9.

[2] Rees JH，Br J Radiol. Diagnosis and treatment in neuro-oncology：An oncological perspective[J]. J Spec，2011，84（2）：82-89.

[3] van den Bent M，Chinot OL，Cairncross JG. Recent developments in the molecular characterization and treatment of oligodendroglial tumors[J]. Neuro-Oncology，2003， 5（1）：128-138.

[4] Kalpathy-Cramer J，Gerstner ER，Emblem KE，et al. Advanced Magnetic ResonanceImaging of the Physical Processes in Human Glioblastoma[J].Cancer Res，2014，74（2）：4622-4637.

[5] Aguilar HN，Hung RW，Mehta V，Kotylak T.Imaging characteristics of an unusual，high-grade angiocentric glioma：A case report and review of the literature[J].J Radiol Case Rep，2012，6（10）：1-10.

[6] Yan T，Skaftnesmo KO，Leiss L，et al. Neuronal markers are expressed in human gliomas and NSE knockdown sensitizes glioblastoma cells to radiotherapy and temozolomide[J].J BMC Cancer，2011，20（11）：524.

[7] 劉睿，張賀龍. S100蛋白家族成員與腫瘤關(guān)系的研究進展[J]. 現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2010，18（1）：200-202.

[8] 盧浩，李娜，尹碩，等. S 100蛋白家族在腫瘤中的研究進展[J]. 醫(yī)學(xué)美學(xué)美容旬刊，2014，（5）：698-699.

[9] Qian YQ，Billeter M，Otting G，et al. The structure of the antennapedia homeodomain determined by NMR spectroscopy in solution：Comparison with prokaryotic repressors[J]. Cell. 1989；59（3）：573-580.

[10] Leniak W，Graczyk-Jarzynka A. The S100 proteins in epidermis：Topology and function[J]. Biochim Biophys Acta，2015，1850（12）：2563-2572.

[11] 陳明凱，張思宇，楊玉秀. 血漿HOXA13蛋白在肝癌診斷中的價值[J]. 河南醫(yī)學(xué)研究，2016，25（6）：974-976.

[12] Quagliata L，Matter MS，Piscuoglio S，et al. Long noncoding RNA HOTTIP/HOXA13 expression is associated withdisease progression and predicts outcome in hepatocellular carcinoma patients[J]. Hepatology，2014，59（3）：911-923.

[13] Pan T， Jia W， Yao Q，et al. Over expression of HOXA13 as a Potential Marker for diagnosis and Poor Prognosis of Hepatocellular Carcinoma[J]. The Tohoku Journal of Experimental Medicine，2014，234（3）：209-219.

[14] Scott V，Morgan EA，Stadler HS. Genitourinary functions of Hoxa13 and Hoxd13[J]. Journal of Biochemistry，2005， 137（6）：671-676.

[15] Duan R，Han L，Wang Q，et al. HOXA13 is a potential GBM diagnostic marker and promotes glioma invasion by activating the Wnt and TGF-β pathways[J]. Oncotarget， 2015，6（29）：27778-27793.

[16] Deng S，Hirschberg A，Worzfeld T，et al. Plexin-B2，but not Plexin-B1，critically modulates neuronal migration and patterning of the developing nervous system in vivo[J].J Neurosci，2007，27（23）：6333-6347.

[17] Azzarelli R，Pacary E，Garg R，et al. An antagonistic interaction between PlexinB2 and Rnd3 controls RhoA activity and cortical neuron migration[J]. Nature Communications，2014，5（2）：3405.

[18] 張赟，李琦，莊然，等. Plexin-B1：新的膠質(zhì)瘤生物標志及免疫治療靶點[C].全國免疫學(xué)學(xué)術(shù)大會，2012.

[19] Towner RA，Jensen RL，Vaillant B，et al. Experimental validation of 5 in-silico predicted glioma biomarkers[J]. Neuro-oncology，2013，15（12）：1625-1634.

[20] Saha B，Ypsilanti AR，Boutin C，et al. Plexin-B2 regulates the proliferation and migration of neuroblasts in the postnatal and adult subventricular zone[J].J Neurosci，2012，32（47）：16892-16905.

[21] Le AP，Huang Y，Pingle SC，et al. Plexin-B2 promotes invasive growth of malignant glioma[J]. Oncotarget，2015， 6（9）：7293-7304.