周景龍

摘要：指出了小桐子雌雄比例失調(diào)，極大地降低了小桐子的產(chǎn)量。從小桐子花入手，通過分子手段來增加雌花比例，進(jìn)而提高小桐子產(chǎn)量。通過SSH和RNA-seq相結(jié)合的方法，共找到候選基因基因3個。并利用premer premier5.0對3個基因設(shè)計引物，以EF1α為內(nèi)參，進(jìn)行qRT-PCR。結(jié)果表明： JCGZ_23177在雌花中高效表達(dá)， JCGZ_06508和 JCGZ_17929在雄花中高效表達(dá)，通過NCBI 數(shù)據(jù)庫分析，3個基因分別為S-腺苷甲硫氨酸合酶1（S-adenosylmethionine synthase 1）、肽甲硫氨酸亞砜還原酶A5（peptide methionine sulfoxide reductase A5）、脂氧合酶6（lipoxygenase 6）。

關(guān)鍵詞：小桐子；抑制性消減雜交技術(shù)；轉(zhuǎn)錄組測序；實(shí)時定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)

中圖分類號：Q949.753.5

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：16749944（2017）10021805

1 引言

小桐子（Jatropha curcas L.），又名麻瘋樹、木生花[1]等，從小桐子種子中提取的生物柴油具有很多優(yōu)點(diǎn)，主要體現(xiàn)在安全性高、可再生、爆發(fā)力強(qiáng)、硫化物排放低、易于運(yùn)輸、污染少等方面，因此，小桐子也被認(rèn)為是目前最有潛力的能源樹種 [2，3]。小桐子雌花少雄花多[4]，若能闡明雌雄花分化機(jī)制便能提高雌花數(shù)量，提高小桐子產(chǎn)量。

2 材料和方法

2.1 實(shí)驗材料

實(shí)驗材料為小桐子雌花、雄花、花芽，取自云南省昭通市巧家縣。實(shí)驗室通過SSH（抑制消減雜交）技術(shù)已成功構(gòu)建了小桐子雌花和雄花、雌花和花芽、雄花和花芽正反抑制消減文庫6個，得到SSH重組菌約200個左右。

2.2 實(shí)驗方法

（1）通過重組菌活化—培養(yǎng)—PCR擴(kuò)增—電泳—測序—去接頭序列—NCBI 同源性分析。

（2）利用NGS（高通量測序技術(shù)）對小桐子轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測序，以|log2（FoldChange）|>1 且 qvalue<0.005為閾值，篩選雌雄花差異表達(dá)基因。

（3）利用SSH和RNA-seq技術(shù)相結(jié)合的方法，篩選候選基因。

（4）利用qRT-PCR（熒光定量PCR）技術(shù)對候選基因進(jìn)行相對定量分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 SHH差異表達(dá)基因篩選

通過NCBI Blast分析可發(fā)現(xiàn)小桐子生長素反應(yīng)因子5、小桐子MADS-box蛋白AGL9、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶、小桐子蔗糖合成酶、14-3-3配體蛋白、蛋白質(zhì)生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)F-box 2、小桐子光敏色素A等多個小桐子已知同源基因，整體數(shù)據(jù)列表見表1。

3.2 RNA-seq原始數(shù)據(jù)分析

RNA-seq得到的原始測序序列，里面含有帶接頭的、低質(zhì)量的reads，為了保證信息分析質(zhì)量，必須對raw reads（原始數(shù)據(jù)）進(jìn)行過濾，得到clean reads，后續(xù)分析都基于clean reads。從圖1可以看出，小桐子雌花、雄花、花芽的clean reads分別占原始數(shù)據(jù)的97.37%、97.50%和97.46%；含 N（N表示無法確定堿基信息）的reads分別占原始數(shù)據(jù)的0.01%、0.01%和0.01%；低質(zhì)量的reads分別占原始數(shù)據(jù)的2.25%、2.18%和2.19%；帶接頭的reads分別占原始數(shù)據(jù)的0.38%、0.31%和0.35%。以上數(shù)據(jù)表明，測序數(shù)據(jù)質(zhì)量好、錯誤率低，可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗。

3.3 RNA-seq差異表達(dá)基因篩選

對差異基因進(jìn)行篩選，從差異倍數(shù)和顯著水平兩個方面進(jìn)行評估，閾值設(shè)定一般為： |log2（FoldChange）|>1 且 qvalue<0.005。獲得C vs X（雌花雄花相互比較）差異基因共有4352個，其中上調(diào)基因2365個，下調(diào)基因1987個；C vs Y（雌花花芽相互比較）差異基因1917個，其中上調(diào)基因900個，下調(diào)基因1017個；X vs Y（雄花花芽相互比較）差異基因5333個，其中上調(diào)基因2076個，下調(diào)基因3257個。

3.4 qPCR總RNA提取

小桐子花組織總RNA的提取采用OMEGA Bio-Tek公司的E.Z.N.ATM Plant RNA 試劑盒，結(jié)果如圖2所示，條帶清晰，28S與18S之比約為2∶1，還可以看到5S，說明RNA提取結(jié)果較好。

3.5 內(nèi)參基因和目的基因引物序列

通過SSH和RNA-seq相結(jié)合的方法，共找到相同基因3個，以EF1α為內(nèi)參，并利用引物設(shè)計軟件Primer premier5.0進(jìn)行引物設(shè)計，結(jié)果見表2。

3.6 qPCR曲線

三個目的基因GCGZ_23177、GCGZ_06508、和GCGZ_17929，每個基因3個復(fù)孔，3種模板，以EF1α為內(nèi)參，內(nèi)參基因和目的基因qPCR熔解曲線和擴(kuò)增曲線見圖3、4、5和6，未見非特異性和引物二聚體峰圖，熒光定量效果較好。

4 結(jié)語

小桐子是目前公認(rèn)的最有潛力的生物能源樹種，其易于種植、管理，且可在條件惡劣的環(huán)境下生長，是國家強(qiáng)力推薦的脫貧致富的良好樹種。生物柴油主要是從小桐子種子中提取，但小桐子雌雄比例失調(diào)，極大的降低了小桐子的產(chǎn)量。據(jù)筆者了解，小桐子雌雄比例一般為1∶10左右[5]，有時甚至可達(dá)到1∶15。本實(shí)驗從小桐子花入手，通過分子手段來增加雌花比例，進(jìn)而提高小桐子產(chǎn)量。

實(shí)驗中通過SSH和RNA-seq相結(jié)合的方法，并進(jìn)行qRT-PCR。結(jié)果表明：JCGZ_23177在雌花中高效表達(dá)， JCGZ_06508和 JCGZ_17929在雄花中高效表達(dá)。由此可知，基因JCGZ_23177、JCGZ_06508、和JCGZ_17929在小桐子雌雄花分化方面具有重要作用。通過NCBI 數(shù)據(jù)庫分析，基因JCGZ_23177、JCGZ_06508、和JCGZ_17929分別為S-腺苷甲硫氨酸合酶1（S-adenosylmethionine synthase 1）、肽甲硫氨酸亞砜還原酶A5（peptide methionine sulfoxide reductase A5）、脂氧合酶6（lipoxygenase 6）。該實(shí)驗通過分子生物學(xué)手段共找到小桐子雌雄花分化的關(guān)鍵基因3個：S-腺苷甲硫氨酸合酶1（S-adenosylmethionine synthase 1）、肽甲硫氨酸亞砜還原酶A5（peptide methionine sulfoxide reductase A5）、脂氧合酶6（lipoxygenase 6），為加快小桐子產(chǎn)業(yè)化步伐起到一定的推動作用。

參考文獻(xiàn)：

[1]李法社. 小桐子生物柴油制備的試驗研究[D]. 昆明：昆明理工大學(xué)， 2008.

[2]Koh M Y， Ghazi T I M. A review of biodiesel production from Jatropha curcas L. oil[J]. Renewable and Sustainable Energy Reviews， 2011， 15（5）： 2240～2251.

[3]張慶豐. 小桐子花發(fā)育調(diào)控基因AGAMOUS和AGAMOUs-LIKE基因的克隆及功能分析[D]. 北京：中國科學(xué)院大學(xué)， 2013.

[4]張 露. 小桐子細(xì)胞分裂素合成代謝關(guān)鍵酶基因的克隆及其功能分析兼論柬埔寨龍血樹的遺傳多樣性[D]. 北京：中國科學(xué)院大學(xué)， 2013.

[5]何 璐， 張 德， 段曰湯，等. 金沙江干熱區(qū)麻瘋樹（Jatropha curcas L.）雜交育種技術(shù)的初步研究[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報， 2012， 25（4）：1422～1426.