趙鵬，江雅，王經(jīng)滿，范浩杰，曹瑞兵

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畢赤酵母分泌表達(dá)JEV prME蛋白及其形成病毒樣顆粒的免疫原性鑒定

趙鵬，江雅，王經(jīng)滿，范浩杰，曹瑞兵

南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院農(nóng)業(yè)部動(dòng)物細(xì)菌學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京 210095

趙鵬, 江雅, 王經(jīng)滿, 等. 畢赤酵母分泌表達(dá)JEV prME蛋白及其形成病毒樣顆粒的免疫原性鑒定. 生物工程學(xué)報(bào), 2017, 33(5): 863–874.Zhao P, Jiang Y, Wang JM, et al. Secreted expression of Japanese encephalitis virus prME in Pichia pastoris and immunogenicity evaluation of the virus-like particles in mice. Chin J Biotech, 2017, 33(5): 863–874.

應(yīng)用畢赤酵母分泌表達(dá)日本腦炎病毒 (Japanese encephalitis virus，JEV) prME蛋白，鑒定其表達(dá)效果與免疫原性，以期為JEV亞單位疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。RT-PCR擴(kuò)增JEV SA14-14-2株基因，將其連接到畢赤酵母表達(dá)載體pPICZa-A，分別獲得pPICZa-prME和攜帶JEV Cap蛋白C末端19個(gè)Aa信號(hào)肽的pPICZa-SprME質(zhì)粒。表達(dá)載體用Ⅰ酶切線性化，通過電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入畢赤酵母X33并誘導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng)。利用SDS-PAGE和Western blotting鑒定酵母發(fā)酵上清中目的蛋白的表達(dá)情況。利用GE蛋白層析純化柱純化目的蛋白，利用電鏡觀察純化前后的目的蛋白，將不同劑量純化后的prME蛋白與弗氏佐劑混合以及定量純化后的prME蛋白與不同劑量的核酸佐劑混合分別免疫4周齡小鼠，定期采血，ELISA檢測(cè)被免小鼠血清的抗體水平，空斑減少試驗(yàn)測(cè)定抗體中和效價(jià)。SDS-PAGE結(jié)果表明畢赤酵母可以分泌表達(dá)完整的prME蛋白，目的蛋白在70–100 kDa之間；Western blotting結(jié)果顯示分泌表達(dá)的prME蛋白具有良好的反應(yīng)原性，進(jìn)一步證明prME蛋白在酵母X33中以整體的形式分泌表達(dá)，沒有發(fā)生水解切割。純化目的蛋白，根據(jù)洗脫時(shí)間和體積表明其分子量大于1×106Da，因此推斷prME蛋白可能形成多聚化的顆粒。電鏡觀察發(fā)現(xiàn)直徑30–50 nm的病毒樣顆粒 (Virus like particles，VLPs)。免疫試驗(yàn)結(jié)果表明，純化后的重組蛋白10–15 μg/只接種小鼠在3周后抗體達(dá)到高峰值，之后逐漸下降，免疫7周后小鼠血清仍可檢測(cè)到JEV抗體。將prME VLPs以10 μg /只的劑量與不同劑量的核酸佐劑配伍后接種小鼠，ELISA檢測(cè)結(jié)果表明核酸佐劑可明顯增強(qiáng)JEV prME VLPs免疫應(yīng)答，免疫4周后小鼠血清的中和抗體效價(jià)為1∶80–1∶160。上述結(jié)果表明畢赤酵母表達(dá)JEVprME雖不能發(fā)生水解切割，但仍可形成VLP并誘導(dǎo)免疫小鼠產(chǎn)生較高水平中和抗體。

日本腦炎病毒，prME蛋白，畢赤酵母，病毒樣顆粒，免疫原性

流行性乙型腦炎是一種由日本腦炎病毒 (Japanese encephalitis virus，JEV) 經(jīng)蚊蟲傳播引起的人畜共患病[1]。JEV與西尼羅病毒 (West nile virus，WNV)、登革熱病毒 (Dengue virus，DENV) 同為黃病毒科黃病毒屬 (Flavivirus) 成員[2]。豬是JEV在自然界的重要儲(chǔ)存宿主和擴(kuò)增宿主，病毒通常在“蚊-豬-蚊”間循環(huán)傳播[3]。JEV是引起母豬繁殖障礙的重要病原之一，可引起懷孕母豬流產(chǎn)、死胎或木乃伊胎，也可引起公豬睪丸急性炎癥。該病在東亞、南亞等地區(qū)廣泛流行，不但對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失，也嚴(yán)重威脅著人類的健康[4]。流行性乙型腦炎的防控主要通過防蚊滅蚊和疫苗免疫。

JEV為球形有囊膜病毒，直徑約40 nm，其基因組為單股正鏈RNA，長(zhǎng)度約為11 kb[5]。prM和E蛋白是JEV的兩個(gè)重要的結(jié)構(gòu)蛋白，各含有一個(gè)糖基化位點(diǎn) (N15，N154)[6]。prM蛋白是未成熟病毒粒子的一部分，分子量為18–19 kDa，prM蛋白在未被宿主細(xì)胞弗林蛋白酶水解前，作為分子伴侶協(xié)助E蛋白進(jìn)行正確的結(jié)構(gòu)折疊、膜定位和病毒的組裝。prM被弗林蛋白酶水解為M蛋白后病毒才成為成熟的病毒粒子[6-9]，M蛋白參與病毒感染過程，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體[6, 10-12]。E蛋白含500個(gè)氨基酸殘基，分子量約為53 kDa，囊膜糖蛋白E是病毒粒子表面主要的結(jié)構(gòu)蛋白，參與病毒復(fù)制的許多過程，包括結(jié)合受體、膜融合和病毒顆粒包裝等[7-9]，E蛋白上有中和抗原表位，可誘導(dǎo)免疫保護(hù)[12]。

病毒樣顆粒 (Virus like particles，VLPs) 是指由某種病毒的一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白自發(fā)組裝形成的顆粒；在形態(tài)上與真正病毒粒子相同或相似，可誘導(dǎo)機(jī)體類似病毒感染的免疫應(yīng)答；且沒有病毒核酸而不能自主復(fù)制，因此具有很好的安全性[13-15]。目前，人乳頭狀瘤病毒 (HPV)[16]和乙型肝炎病毒[17]核衣殼蛋白VLP抗原疫苗已得到廣泛應(yīng)用，H9N2流感病毒[18]和Chikungunya病毒[19]囊膜蛋白VLP抗原疫苗已經(jīng)研制成功并獲得商業(yè)化生產(chǎn)。

畢赤酵母真核表達(dá)系統(tǒng)，可對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行加工折疊和翻譯后修飾，從而使表達(dá)出的蛋白具有生物活性[7, 20-21]。應(yīng)用畢赤酵母甲醇氧化酶 (AOX1) 基因啟動(dòng)子，可嚴(yán)格調(diào)控外源蛋白的表達(dá)。Liu等報(bào)道應(yīng)用畢赤酵母成功表達(dá)出DENV prME蛋白，并自發(fā)組裝形成VLP，免疫小鼠可有效抵御同型DENV的感染致病[21]。

本研究應(yīng)用畢赤酵母表達(dá)JEV prME蛋白，發(fā)現(xiàn)該蛋白可以被分泌表達(dá)至酵母菌培養(yǎng)液中，prME沒有發(fā)生切割，但仍可自發(fā)組裝成病毒樣顆粒，畢赤酵母表達(dá)的JEV VLPs免疫小鼠可誘導(dǎo)產(chǎn)生較高水平的中和抗體。本研究為下一步研制流行性乙型腦炎亞單位疫苗提供了新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物、菌株和質(zhì)粒

4周齡SPF ICR小鼠購自上海西普爾必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。大腸桿菌TOP10株、畢赤酵母X33、JEV SA14-14-2株、JEV NJ2008株、BHK細(xì)胞由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院農(nóng)業(yè)部動(dòng)物疫病診斷與免疫實(shí)驗(yàn)室保存。pPICZa-A表達(dá)載體購自Invitrogen公司。

1.1.2 主要生化試劑與酶

Trizol、PrimeScriptTMRT-PCR kit、Premixed protein marker、DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、RⅠ、Ⅰ、Ⅰ、DNA marker均為TaKaRa公司產(chǎn)品；弗氏佐劑、核酸佐劑為Sigma公司產(chǎn)品[22]；ZeocinTM為Invitrogen公司產(chǎn)品；鼠源JEV E蛋白單克隆抗體4H1為本實(shí)驗(yàn)室自制；鼠源JEV prM單克隆抗體HZ由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)提供；山羊抗小鼠-IgG-HRP購自優(yōu)寧維公司；NC膜、濾紙購自Promega公司；SDS、Tris-HCl、30%丙烯酰胺、考馬斯亮藍(lán)R-250、TEMED、過硫酸胺、酵母粉、蛋白胨、生物素、酵母氮源培養(yǎng)基、葡萄糖等常用試劑均購自上海生工生物工程有限公司；引物合成、基因測(cè)序由上海華大基因有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 JEV prME基因的克隆與鑒定

用Trizol提取JEV疫苗株SA14-14-2 RNA，按照Prime-ScriptTMRT-PCR kit的說明，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)GenBank公布的SA14-4-2 strain (GenBank Accession No. JN604986) 序列，應(yīng)用DNAstar (Version4.0) 及Primer (Version 5.0) 基因分析軟件，設(shè)計(jì)擴(kuò)增JEV基因引物序列JE1、JE2及擴(kuò)增不含Cap C端信號(hào)肽的JEV基因引物序列JE3、JE4 (表1)。以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系：DNA擴(kuò)增酶25 μL，上下游引物各1.0 μL，cDNA為3.0 μL，加ddH2O至總體積為50 μL。PCR程序：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。PCR結(jié)束后，反應(yīng)產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測(cè)，觀察并記錄結(jié)果。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行膠回收，并對(duì)回收結(jié)果進(jìn)行凝膠檢測(cè)。

1.2.2 JEV prME酵母表達(dá)載體的構(gòu)建

將膠回收的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物JEV基因與pPICZa-A質(zhì)粒用RⅠ、Ⅰ進(jìn)行雙酶切，將酶切后的基因片段用T4DNA連接酶連接到pPICZa-A載體上，再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單菌落進(jìn)行重組質(zhì)粒提取，經(jīng)雙酶切鑒定正確后送上海華大基因有限公司測(cè)序。含有編碼prM蛋白前19個(gè)氨基酸信號(hào)肽的重組質(zhì)粒命名為pPICZa-SprME，不含Cap C端信號(hào)肽基因的重組質(zhì)粒命名為pPICZa-prME。

表1 PCR所需引物序列

1.2.3 導(dǎo)入JEV prME基因的畢赤酵母X33菌株陽性克隆篩選鑒定

將重組質(zhì)粒pPICZa-SprME和pPICZa-prME用Ⅰ酶線性化后，回收線性化質(zhì)粒，采用電轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入到畢赤酵母菌X-33中，將質(zhì)粒與酵母感受態(tài)混合放于0.2 cm電擊杯中(BIO-RAD)，電轉(zhuǎn)條件為1.5 kV，5 ms，25 F，200 Ω。將電轉(zhuǎn)化之后的轉(zhuǎn)化菌在酵母培養(yǎng)箱30 ℃靜置3 h后，涂布于YPD (1%酵母粉，2%蛋白胨，2%葡萄糖，2%瓊脂粉，添加ZeocinTM100 μg/mL) 平板，倒置，酵母培養(yǎng)箱30 ℃靜置培養(yǎng)3–5 d。挑取單菌于YPD培養(yǎng)液中，加入1‰ (/) Zeocin，30 ℃培養(yǎng)16–18 h，通過煮-凍-煮的方法提取畢赤酵母X33基因組，以基因組DNA為模板，應(yīng)用引物AOX1F和AOX1R進(jìn)行PCR鑒定，引物序列見表1，PCR步驟同1.2.1。接菌環(huán)蘸取陽性菌液在含200 μg/mL ZeocinTMYPD固體培養(yǎng)基劃線，30 ℃培養(yǎng)3–5 d，獲得基因陽性重組酵母菌。

1.2.4 JEV prME重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

用滅菌牙簽挑取Zeocin抗性YPD平板上生長(zhǎng)的單菌落，接種于5 mL的BMGY (1%酵母粉，2%蛋白胨，100 μmol/L磷酸鹽緩沖液 (pH 6.0)，1.34%酵母氮源培養(yǎng)基，4×10–5%生物素，1%甘油) 液體培養(yǎng)基中，在50 mL體積錐形瓶中進(jìn)行激活培養(yǎng)，瓶口覆蓋兩層紗布，30 ℃、220 r/min振蕩16–20 h，至600值約為2–6，此時(shí)酵母菌處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。收集菌液，5 000 r/min室溫離心5 min，收集沉淀，重懸于1 mL的BMMY (與BMGY的區(qū)別是不含1% 甘油，而含有1%甲醇) 中，轉(zhuǎn)入50 mL BMMY液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)在250 mL體積錐形瓶中振蕩培養(yǎng)。每間隔24 h加入250 μL 100%甲醇，進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。試驗(yàn)同時(shí)設(shè)轉(zhuǎn)化空載體pPICZa-A的酵母菌株為陰性對(duì)照。培養(yǎng)至96 h收集樣品，室溫12 000 r/min離心5 min，取上清液，SDS-PAGE分析蛋白表達(dá)情況。

1.2.5 酵母分泌表達(dá)的JEV prME蛋白的層析純化與鑒定

將離心收集的酵母表達(dá)上清用0.22 μm無菌濾器過濾，收集濾液，用蛋白濃縮柱 (Biomax100，Millipore，Bedford，USA) 濃縮濾液，3 500×、4 ℃離心25 min。取濃縮液2 mL，用蛋白純化層析柱HiPrep 16/60 Sephacry (S-400 High Resolution，GE) 純化，流速為15 cm/h，定時(shí)分管收集流出液，每管3 mL，記錄對(duì)應(yīng)吸收峰，再將收集的蛋白純化液使用蛋白濃縮柱濃縮，SDS-PAGE鑒定各層析組分。

通過Western blotting檢驗(yàn)純化后的重組目的蛋白，陰性對(duì)照為轉(zhuǎn)化的空載體pPICZa-A酵母菌表達(dá)上清。SDS-PAGE后0.33 A恒流轉(zhuǎn)膜 3 h。用5%脫脂奶粉常溫封閉1.5 h，PBST漂洗3次后，分別加入1∶1 000稀釋的抗JEV prM、E 蛋白的鼠源一抗，室溫孵育2 h；PBST漂洗3次后，加入1∶3 000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體 (二抗)，室溫孵育1.5 h，PBST漂洗3次后用Western blotting發(fā)光液和曝光機(jī) (均購自南京Tanon公司)，觀察目的條帶并記錄結(jié)果。

將畢赤酵母表達(dá)的JEV prME蛋白上清和純化濃縮上清在HITACHI-7650透射電鏡下觀察并記錄結(jié)果。使用BioPhotometer D30核酸蛋白測(cè)定儀 (德國，Eppendorf) 測(cè)定純化濃縮后的prME蛋白濃度。

1.2.6 動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)

為了分析酵母分泌表達(dá)JEV蛋白的免疫原性，開展了2次小鼠免疫實(shí)驗(yàn)。

第一次試驗(yàn)將25只4周齡雌性ICR小鼠分成5組，其中4組接種不同劑量 (2.5 μg、5.0 μg、10.0 μg和15.0 μg/小鼠) 純化后的重組prME蛋白，免疫前抗原與弗氏完全佐劑 (Sigma公司) 以1∶1的體積混合，腹腔和背部皮下多位點(diǎn)免疫小鼠。陰性對(duì)照組小鼠接種200 μL PBS。

第二次動(dòng)物試驗(yàn)將25只4周齡雌性ICR小鼠分成5組，其中4組分別接種純化后的重組prME蛋白10.0 μg，免疫前與不同劑量的核酸佐劑 (Sigma公司) (0 μL、1 μL、5 μL、15 μL/小鼠) 配伍，核酸佐劑的濃度為50 mg/mL，腹腔和背部皮下多位點(diǎn)免疫小鼠。陰性對(duì)照組小鼠接種200 μL PBS。

定期收集小鼠血液，將血液樣品收集到無菌血液收集管中并使其在室溫下凝結(jié)2 h，4 ℃、4 500 r/min離心15 min。采集的血清在–20 ℃下儲(chǔ)存，用于后期ELISA檢測(cè)抗體及測(cè)定中和效價(jià)。

1.2.7 ELISA檢測(cè)小鼠血清樣品中JEV特異性抗體

應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)室建立的JEV抗體檢測(cè)ELISA，主要步驟為用純化的JEV ED3蛋白作為檢測(cè)抗原包被板條，4 ℃過夜，將ELISA板條用封閉緩沖液 (PBS加2% BSA) 封閉，37 ℃下溫育2 h，然后用PBST洗滌3次；加入1∶100稀釋的小鼠血清樣品，在37 ℃下溫育1.5 h；洗滌3次，加入1∶3 000稀釋的HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG抗體，在37 ℃下溫育1.5 h；用PBST洗滌3次，用TMB和磷酸鹽緩沖液制備顯色液，依次加入到每個(gè)孔中，37 ℃下作用10 min，終止顯色，讀取450數(shù)值。

1.2.8 微量空斑減少試驗(yàn)測(cè)定小鼠血清樣品中JEV特異性中和抗體水平

將56 ℃滅活的血清樣品10倍稀釋后再進(jìn)行倍比稀釋，與50PFU/0.25mL的JEV NJ2008株混合后溫育，37 ℃作用1.5 h，分別加入到長(zhǎng)滿BHK單層細(xì)胞的24孔板中，37 ℃孵育1.5 h后棄去混合液；然后加入0.8 mL 1∶1體積的1%瓊脂糖和2×DMEM (含有4% FBS和2%雙抗)，37 ℃ CO2培養(yǎng)箱中孵育，每天觀察1次；3–4 d后出現(xiàn)空斑，在24孔板中加入結(jié)晶紫染色液并在室溫下靜置12 h固定。然后小心地棄去瓊脂糖單層覆蓋層，觀察并記錄結(jié)果。中和抗體效價(jià)計(jì)算方法為抑制50%或更多的噬斑形成的最高小鼠血清稀釋倍數(shù)的倒數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 JEV prME酵母表達(dá)載體雙酶切鑒定及轉(zhuǎn)化酵母陽性克隆的篩選

以JEV SA-14-14-2株RNA為模板RT-PCR擴(kuò)增得到大小約為2 kb的JEV基因克隆到pPICZa-A載體中，將構(gòu)建的表達(dá)JEV prME蛋白的載體pPICZa-SprME和pPICZa-prME分別用RⅠ、Ⅰ雙酶切鑒定 (圖1A)，表明成功構(gòu)建表達(dá)載體。應(yīng)用AOX1檢測(cè)引物PCR擴(kuò)增鑒定經(jīng)電轉(zhuǎn)化后長(zhǎng)出的畢赤酵母菌X33單菌落，PCR結(jié)果約為2 400 bp，與理論值相符 (圖1B)，表明獲得JEV基因轉(zhuǎn)化陽性畢赤酵母菌株。

2.2 JEV prME基因轉(zhuǎn)化陽性畢赤酵母菌株的誘導(dǎo)表達(dá)鑒定

將收獲的JEV基因轉(zhuǎn)化陽性畢赤酵母菌發(fā)酵液離心取上清，過濾后4 ℃保存?zhèn)溆谩DS-PAGE鑒定基因轉(zhuǎn)化陽性畢赤酵母菌表達(dá)產(chǎn)物，結(jié)果表明pPICZa-prME/X33和pPICZa- SprME/X33表達(dá)上清比pPICZa-A/X33表達(dá)上清均有一條增加的條帶，分子量介于70–100 kDa之間 (圖2)。JEV prME蛋白的理論大小為72 kDa，與表達(dá)產(chǎn)物分子量相近，表明畢赤酵母表達(dá)prME蛋白沒有發(fā)生酶解切割。多次發(fā)酵比對(duì)發(fā)現(xiàn)pPICZa-SprME/X33表達(dá)上清中目的蛋白的含量明顯高于pPICZa-prME/X33，因此盡管pPICZa-A表達(dá)載體帶有信號(hào)肽編碼基因，JEV Cap末端19個(gè)Aa的信號(hào)肽序列促進(jìn)了prME蛋白的分泌表達(dá)。

圖1 JEV prME酵母表達(dá)載體雙酶切及轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌鑒定

圖2 酵母表達(dá)重組蛋白分析

為了進(jìn)一步鑒定酵母表達(dá)產(chǎn)物的特異性，分別應(yīng)用JEV E蛋白單克隆抗體4H1和prM蛋白單克隆抗體HZ對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行免疫印跡鑒定 (圖3)。陽性對(duì)照J(rèn)EV NJ2008株BHK細(xì)胞毒分別在53 kDa和20 kDa位置出現(xiàn)特異條帶，而酵母表達(dá)產(chǎn)物均在72 kDa附近出現(xiàn)特異條帶，進(jìn)一步表明畢赤酵母表達(dá)蛋白沒有發(fā)生酶解切割。

2.3 畢赤酵母分泌表達(dá)JEV prME蛋白的層析純化與鑒定

根據(jù)SDS-PAGE鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，pPICZa- SprME/X33表達(dá)的目的蛋白含量明顯高于pPICZa-prME/X33，所以后期選取pPICZa- SprME/X33表達(dá)上清用于目的蛋白的純化和動(dòng)物免疫試驗(yàn)。將pPICZa-SprME/X33表達(dá)上清用100 kDa規(guī)格的蛋白濃縮柱離心、濃縮5倍。將濃縮的酵母表達(dá)產(chǎn)物用S-400 High Resolution HiPrep 16/60 Sephacry 層析柱純化 (圖4A)，收集各吸收峰的層析產(chǎn)物，SDS-PAGE鑒定純化產(chǎn)物 (圖4B)，發(fā)現(xiàn)表達(dá)產(chǎn)物主要存在于第一流出峰，該流出峰對(duì)應(yīng)的層析產(chǎn)物大小理論值為1×106–20×106Da，遠(yuǎn)大于prME單體的分子量72 kDa，表明酵母表達(dá)的JEV prME蛋白可自發(fā)組裝成多聚體。

BioPhotometer D30核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)純化濃縮后的JEV prME蛋白濃度為150 μg/mL，由于該濃度為樣品濃縮后所得，根據(jù)濃縮倍數(shù)推算，最初pPICZa-SprME/X33表達(dá)的目的蛋白濃度約為35 μg/mL。

2.4 畢赤酵母分泌表達(dá)JEV prME蛋白透射電鏡觀察結(jié)果

畢赤酵母表達(dá)上清液直接負(fù)染后電鏡觀察，可看到直徑在30–50 nm之間的病毒樣顆粒(圖5A)，純化濃縮后的表達(dá)產(chǎn)物在透射電鏡下觀察，可看到較多蛋白顆粒 (圖5B)。因此，盡管畢赤酵母X33分泌表達(dá)的prME蛋白沒有發(fā)生類似哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)體系中的pr-M-E之間的酶解切割，仍可自發(fā)組裝成病毒樣顆粒。

2.5 畢赤酵母表達(dá)prME VLPs免疫小鼠的抗體應(yīng)答特征

將不同劑量純化后的畢赤酵母表達(dá)的prME VLPs與弗氏完全佐劑等體積混合后單次免疫4周齡ICR小鼠，ELISA檢測(cè)采集血清中JEV特異性抗體水平。結(jié)果表明(圖6A)，prME VLPs誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生具有抗原劑量相關(guān)性；10–15 μg/只接種小鼠在1 wpi即可發(fā)現(xiàn)JEV抗體轉(zhuǎn)陽，3 wpi達(dá)到高峰，隨后抗體水平逐漸下降，但在7 wpi仍為JEV 抗體陽性；2.5–5 μg/只接種小鼠產(chǎn)生的抗體應(yīng)答不顯著，沒有出現(xiàn)高峰。為了探討核酸免疫佐劑對(duì)酵母表達(dá)prME VLPs免疫小鼠效果的影響，將純化后的prME VLPs以10 μg/只的劑量與不同體積的核酸佐劑配伍后免疫小鼠，ELISA檢測(cè)結(jié)果表明核酸佐劑可明顯增強(qiáng)小鼠對(duì)prME VLPs免疫應(yīng)答 (圖6B)。為了分析prME VLPs免疫小鼠是否誘導(dǎo)JEV中和抗體，選取接種劑量為prME 10 μg+15 μL小鼠4 wpi血清，通過微量空斑減少試驗(yàn)檢測(cè)JEV中和抗體水平，結(jié)果顯示免疫4周后小鼠血清的JEV中和抗體效價(jià)為1∶80–1∶160 (圖6C)，表明畢赤酵母表達(dá)的prME VLPs可有效誘導(dǎo)JEV中和抗體的產(chǎn)生。

圖5 透射電鏡觀察畢赤酵母分泌表達(dá)JEVprME蛋白

3 討論

本研究實(shí)現(xiàn)了JEV prME蛋白在畢赤酵母X33中的分泌表達(dá)，純化濃縮后的目的蛋白含量約為150 μg/mL。盡管畢赤酵母分泌表達(dá)的JEV prME蛋白沒有發(fā)生類似哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)產(chǎn)物prM與E之間的酶解切割，但JEVprME蛋白在畢赤酵母分泌表達(dá)過程中仍可自發(fā)組裝成病毒樣顆粒。酵母分泌表達(dá)的JEV prME VLPs誘導(dǎo)免疫小鼠產(chǎn)生了較高水平的JEV特異性中和抗體。從而為研制新型的流行性乙型腦炎亞單位疫苗提供新的思路。

JEV在翻譯過程中首先產(chǎn)生多聚蛋白，然后被病毒編碼的NS3蛋白酶和宿主細(xì)胞弗林蛋白酶等切割為C、prM和E共3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白以及NS1等7種非結(jié)構(gòu)蛋白[10]。prM和E被宿主細(xì)胞弗林蛋白酶切割后，共同組裝成病毒的囊膜，在病毒的成熟過程中pr被進(jìn)一步酶解[11-12]。本研究發(fā)現(xiàn)酵母分泌表達(dá)JEV prME重組蛋白過程中prM與E不能被有效水解切割，可能是因?yàn)楫叧嘟湍覆槐磉_(dá)弗林蛋白酶。但這并沒有影響prME蛋白在酵母菌內(nèi)的折疊組裝，在電鏡下觀察到畢赤酵母X33表達(dá)上清及純化后的目的蛋白均存在直徑為30–50 nm的病毒樣顆粒，表明prME重組蛋白在畢赤酵母X33中可自發(fā)組裝成VLPs。

研究還發(fā)現(xiàn)，與pPICZa-prME/X33相比，pPICZa-SprME/X33分泌表達(dá)prME蛋白的產(chǎn)量顯著提高。因此，盡管pPICZa-A表達(dá)載體帶有醇氧化酶的信號(hào)肽編碼基因，JEV Cap末端19個(gè)aa的信號(hào)肽序列促進(jìn)了prME蛋白的分泌表達(dá)，可能與JEV prM蛋白自身信號(hào)肽促進(jìn)prME蛋白早期正確折疊有關(guān)。

本研究中畢赤酵母X33分泌表達(dá)JEVprME蛋白純化濃縮后濃度約為150 μg/mL，最初的表達(dá)量不夠理想，還不能滿足規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)的要求。接下來的研究中，我們將通過Zeacin抗性篩選含多拷貝目的基因的酵母菌株、信號(hào)肽的優(yōu)化、表達(dá)基因密碼子畢赤酵母偏嗜性改造等多個(gè)途徑進(jìn)一步探究如何提高JEVprME蛋白的表達(dá)量[19, 23-24]。此外，我們?cè)O(shè)想用畢赤酵母X33共表達(dá)弗林蛋白酶和JEV prME蛋白，使prME蛋白能有效地被水解成M和E蛋白，進(jìn)而使prM與 E蛋白組裝形成VLP，在結(jié)構(gòu)和形態(tài)上與天然病毒顆粒更相似。

將畢赤酵母表達(dá)的prME VLPs單次免疫小鼠后，ELISA檢測(cè)結(jié)果表明小鼠在接種1周后即出現(xiàn)JEV特異性抗體明顯轉(zhuǎn)陽，并逐漸上升，3 wpi達(dá)到高峰，并維持抗體陽性較長(zhǎng)時(shí)間，并且被免小鼠血清抗體具有中和JEV活性。該結(jié)果表明畢赤酵母分泌表達(dá)的JEV prME VLPs具有與天然病毒相似的免疫原性，與文獻(xiàn)報(bào)道的酵母表達(dá)DENV、Chikungunya VLPs免疫效果相似[22, 25-26]。此外，畢赤酵母表達(dá)的JEV prME VLPs具有快速誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體的特性，在應(yīng)用于緊急免疫接種的情況下更有優(yōu)勢(shì)。

本研究還鑒定了核酸佐劑配伍JEV prME VLPs免疫小鼠的效果，結(jié)果表明，核酸佐劑有很好的免疫增強(qiáng)功能，可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生更強(qiáng)的免疫應(yīng)答。VLPs是純蛋白抗原，不能有效刺激細(xì)胞模式識(shí)別受體、激發(fā)先天性免疫應(yīng)答，核酸佐劑的配伍可彌補(bǔ)其中不足。后繼的試驗(yàn)將具體研究被免小鼠細(xì)胞免疫應(yīng)答效果。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)畢赤酵母表達(dá)JEVprME蛋白雖不能發(fā)生水解切割，但仍可形成VLPs并誘導(dǎo)免疫小鼠產(chǎn)生較高水平中和抗體，從而為今后研制JEV亞單位疫苗抗原提供新思路。

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

Secreted expression of Japanese encephalitis virus prME inand immunogenicity evaluation of the virus-like particles in mice

Peng Zhao, Ya Jiang, Jingman Wang, Haojie Fan, and Ruibing Cao

Key Laboratory of Animal Bacteriology, Ministry of Agriculture, College of Veterinary Medicine, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, Jiangsu, China

The study was to express prME protein of Japanese encephalitis virus (JEV) inandthen to evaluate the immunological properties of the recombinant protein in mice, so as to explore a new way for subunit vaccine development of JEV. The JEVgene was amplified by RT-PCR with genome RNA of JEV vaccine strain SA14-14-2 and subcloned into pPICZa-A vector, designated as pPICZα-prME. pPICZα-SprME was constructed same as pPICZα-prME besides with the additional 19 Aa signal peptides coding gene of the JEV cap protein C terminal. Thelinearized expression vector was integrated into the genome ofX33 under the control of the alcohol oxidase (AOX1) promoter and induced with methanol during fermentation expression. The expression of JEV prME protein was identified by SDS-PAGE and Western blotting, and then it was purified by S-400 High Resolution HiPrep 16/60 Sephacry. The expressed products ofwere visualized by electron microscopy. In the immunization test, four groups of four-week old female mice were immunized subcutaneously with different doses purified JEV prME protein with complete Freund’s adjuvant at a volumetric ratio of 1:1 and a control group was injected with sterile PBS. 10 μg/dose purified JEV prME protein mixing different doses nucleic acid adjuvant (Naa) was vaccinated in mice as the same mode. SDS-PAGE and Western blotting indicate that JEV prME was not cleaved between prM and E during secreted expression inThe purified recombinant prME was eluted in the first eluting peak which indicated that its molecular weight about 1×106Da to 20×106Da and may form a multimeric. Both the culture supernatant and the purified protein, examined by electron microscopy, we found to contain JEV virus like particles (VLPs) with diameters of 30–50 nm. The anti-JEV VLPs antibody titration reached peak at 3 wpi and still maintained in mice at 7 wpi inoculated with 10 μg and 15 μgprME. The strong antibody response was observed when the mice immunized with prME mixing nucleic acid adjuvant, which elicited high neutralizing antibody titer among 1:80 to 1:160. In conclusion, although JEV prME protein expressed inwas not cleaved, which formed VLPs and showed efficient immunological properties in mice experiments.

Japanese encephalitis virus,prME protein,, virus like particles, immunological properties

January 21, 2017; Accepted:April 5, 2017

Ruibing Cao. Tel: +86-25-84397619; E-mail: crb@njau.edu.cn

10.13345/j.cjb.170026

Supported by:Special Funds for Agro-scientific Research in the Public Interest (No. 201203082).

國家公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(No. 201203082) 資助。