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        等溫核酸擴增技術(shù)進展

        2017-07-05 08:53:25梁海燕劉文鑫楊志剛
        中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新 2017年16期

        梁海燕 劉文鑫 楊志剛

        【摘要】 等溫核酸擴增技術(shù)已廣泛應(yīng)用于生物分析的體外核酸擴增,本文綜合國內(nèi)外報道,對等溫核酸擴增技術(shù)的進展進行簡要綜述,包括依賴核酸序列型擴增(NASBA)、鏈置換擴增(SDA)、滾環(huán)擴增(RCA)、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(LAMP)、單引物等溫擴增(SPIA)、交叉引物等溫擴增(CPA)、新型等溫多自配引發(fā)擴增(IMSA)的原理、重要特性、應(yīng)用及未來的展望。

        【關(guān)鍵詞】 等溫核酸擴增; 依賴核酸序列型擴增; 鏈置換擴增; 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增; 新型等溫多自配引發(fā)擴增

        Progress of Isothermal Nucleic Acid Amplification Techniques/LIANG Hai-yan,LIU Wen-xin,YANG Zhi-gang.//Medical Innovation of China,2017,14(16):145-148

        【Abstract】 Isothermal nucleic acid amplification techniques have been widely used in vitro nucleic acid amplification for bioanalysis.This paper gives a brief review of isothermal nucleic acid amplification technologies such as NASBA,SDA,RCA,LAMP,SPIA,CPA and IMSA.Starting off from their amplification mechanisms and significant properties,the application in bioanalytical chemistry and their future perspectives are discussed.

        【Key words】 Isothermal nucleic acid amplification; NASBA; SDA; LAMP; IMSA

        First-authors address:Affiliated Hospital of Guangdong Medical University,Zhanjiang 524001,China

        doi:10.3969/j.issn.1674-4985.2017.16.042

        核酸基于其生物特性被用來作為生物研究和醫(yī)療診斷的重要生物標(biāo)志物。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是第一個也是最受歡迎的用于擴增及低豐度檢測核酸擴增技術(shù)。盡管PCR技術(shù)被廣泛地應(yīng)用到各個領(lǐng)域,但他需要反復(fù)的熱循環(huán)及精密儀器的缺點限制了其在資源有限或?qū)嵉胤治鲋械膽?yīng)用。近年來出現(xiàn)及迅猛發(fā)展的等溫核酸擴增技術(shù)有望成為未來發(fā)展的新趨勢,因為其只需恒溫裝置(例如:水浴鍋),便能進行快速且高效的擴增反應(yīng)。從20世紀(jì)90年代始,很多等溫核酸擴增技術(shù)被發(fā)展起來,多種等溫擴增方法都具有高靈敏度,而且有部分技術(shù)已成功轉(zhuǎn)向商業(yè)化[1]。在眾多的等溫擴增技術(shù)中,環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)應(yīng)用范圍較為廣泛,其他的等溫擴增技術(shù)還有依賴核酸序列型等溫擴增、鏈置換等溫擴增、滾環(huán)等溫擴增、單引物等溫擴增、交叉引物等溫擴增。本文綜述了這些等溫擴增技術(shù)及其在分子診斷的應(yīng)用,并探討等溫擴增技術(shù)的發(fā)展及前景。

        2 等溫核酸擴增技術(shù)

        2.1 依賴核酸序列型擴增技術(shù) 依賴核酸序列型擴增技術(shù)(nucleic acid sequence-based amplification,NASBA)[2],是一種基于轉(zhuǎn)錄依賴擴增系統(tǒng)建立起來的等溫擴增技術(shù)。NASBA通過模擬逆轉(zhuǎn)錄病毒復(fù)制方式設(shè)計而成,用于擴增單鏈RNA序列。NASBA的基本原理是模板RNA被反義引物識別,并在逆轉(zhuǎn)錄酶的RNA依賴型DNA聚合酶活性作用下形成互補DNA鏈,而RNA-DNA復(fù)合體被核糖核酸酶H(RNase H)處理,使得原來的RNA鏈被降解,接著在逆轉(zhuǎn)錄酶的DNA依賴型DNA聚合酶活性作用下,含T7啟動子的特異引物(oligdNTP)識別新合成的單鏈DNA鏈,形成含T7啟動子的雙鏈DNA結(jié)構(gòu),該結(jié)構(gòu)可作為隨后循環(huán)擴增的底物。T7RNA聚合酶能夠使帶T7啟動子的DNA鏈作為模板合成與原來RNA鏈序列相似的新的RNA鏈。

        通常NABSA能在41℃條件下進行,經(jīng)過1.5~2 h的擴增可將模板RNA放大至109倍,靈敏度與RT-PCR的相當(dāng)。NABSA的終產(chǎn)物可用凝膠電泳、實時熒光法、比色法及電化學(xué)發(fā)光法檢測,F(xiàn)DA已批準(zhǔn)使用NASBA技術(shù)在HCV和HIV-1等一些微生物的分子檢測[3-4]。

        2.2 鏈置換擴增技術(shù) 鏈置換擴增技術(shù)(strand displacement amplification, SDA)在1992年首次由Walker等提出,與NABSA不同的是,SDA是依靠酶促反應(yīng)進行的DNA體外核酸等溫擴增。其擴增過程需要經(jīng)過DNA單鏈模板的準(zhǔn)備、5端3端均含酶切位點的目的DNA片段的生成和鏈置換反應(yīng)三個階段。理論上,SDA在37~40 ℃進行23次循環(huán)后,2 h內(nèi)靶序列可得到108擴增[5]。

        在SDA產(chǎn)物檢測上Walker等將熒光技術(shù)與SDA結(jié)合,建立了SDA的熒光偏振(Fluorescence polarization,F(xiàn)P)檢測方法。Spears等[6]將熒光探針加入到SDA的循環(huán)階段,建立了同步SDA熒光偏振(simultaneous SDA and FP detection)檢測技術(shù),并成功應(yīng)用于沙眼衣原體檢測。有關(guān)學(xué)者將SDA與壓電DNA傳感器技術(shù)相結(jié)合,研制了SDA壓電DNA傳感器,并對33份臨床樣本進行銅綠假單胞菌檢測,其結(jié)果與熒光定量PCR結(jié)果一致,且更快速、靈敏。SDA技術(shù)也用于病毒RNA的檢測,如Mehrpouyan等[7]用SDA技術(shù)建立了對HIV-1病毒的檢測,SDA技術(shù)在結(jié)核病、基因診斷等方面也已有報道[8]。

        2.3 滾環(huán)擴增技術(shù) 滾環(huán)擴增技術(shù)(rolling circle amplification,RCA)是借鑒自然界中環(huán)狀DNA分子滾環(huán)式特定復(fù)制方式建立的等溫擴增技術(shù)[9]。RCA線性擴增是在DNA聚合酶作用下,環(huán)狀DNA與引物結(jié)合后進行延伸,生成大量與環(huán)狀DNA互補的重復(fù)序列的線狀DNA單鏈。指數(shù)RCA采用與環(huán)狀DNA序列一致的第二種引物,此引物與線性RCA產(chǎn)物結(jié)合并酶促延伸,產(chǎn)物又作為第一種引物的模板進行反應(yīng),因此使產(chǎn)物能在短時間內(nèi)呈指數(shù)擴增。指數(shù)RCA也可用于非環(huán)狀DNA的擴增。RCA很明顯的缺點是其線性RCA只能用于檢測一些具有環(huán)狀核酸的病毒、質(zhì)粒和環(huán)狀染色體等,而合成指數(shù)RCA鎖式探針的成本高及檢測時存在信號背景問題[10]。

        RCA被用于擴增及檢測DNA及RNA的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)[11-12],這是第一個完成從雙螺旋DNA或者mRNA轉(zhuǎn)變?yōu)閱捂淒NA的檢測方法。目前已經(jīng)用RCA技術(shù)發(fā)展了TempliPhi DNA測序模板擴增試劑盒。在腫瘤的早期核酸檢測和檢測分析,RCA也是一個很有潛力的分析工具。

        2.4 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù) 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)是Notomi等于2000年首先提出的一種新的等溫核酸擴增技術(shù)。該法使用4條引物(外引物F3/B3、內(nèi)引物FIP/BIP)來識別6個特異性DNA結(jié)合位點,以及鏈置換功能的Bst DNA聚合酶,來實現(xiàn)核酸的擴增檢測。LAMP擴增包括啞鈴狀模板合成階段、循環(huán)擴增階段、伸長和再循環(huán)階段。其基本原理是在目的雙鏈DNA解鏈后,內(nèi)外引物識別相應(yīng)的位點,在Bst DNA聚合酶作用下延伸。當(dāng)外引物延伸至內(nèi)引物處時可將內(nèi)引物形成的鏈置換出來,而后形成一個啞鈴樣DNA結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)再不斷被引物識別、延伸和擴增后最終形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)和多環(huán)花椰菜樣結(jié)構(gòu)的DNA片段混合物[13]。

        LAMP擴增產(chǎn)物的檢測方法多種多樣,包括瓊脂糖凝膠電泳法、濁度檢測法、顏色判定法,而顏色判定法所用顯色劑又分兩類:一類是金屬離子指示劑,如鈣黃綠素、羥基萘酚藍(HNB)、鈣黃綠素和HNB的組合等;另一類是核酸染料指示劑,如SYBR Green I、GeneFinder和碘化丙啶等。

        LAMP技術(shù)自開發(fā)以來,備受研究者的青睞,已經(jīng)成為分子檢測技術(shù)大家庭的佼佼者。早在2003年,LAMP就用于微生物及病毒,如流感病毒H5的檢測[14],也被用于胚胎性別鑒定的檢測[15]。其應(yīng)用領(lǐng)域廣泛,還包括針對細菌[16]、寄生蟲[17]、真菌[18]等致病原的快速檢測。而且,Eiken化學(xué)公司(http://www.eiken.co.jp/en/product/index.html)生產(chǎn)了LAMP檢測法的商業(yè)試劑盒。

        2.5 單引物等溫擴增 單引物等溫擴增(single primer isothermal amplification,SPIA)技術(shù)的擴增反應(yīng)是由雜交引物結(jié)合至靶DNA的互補序列上開始的[19],而在DNA聚合酶的作用下,雜交引物及靶DNA序列進行延伸。隨著引物的延伸,雜交引物(RNA—DNA引物)的5端RNA片段被RNase H選擇性地降解,以釋放部分靶DNA序列上的結(jié)合位點,從而又可結(jié)合新的嵌合引物。新的嵌合引物需與之前引物延伸的產(chǎn)物競爭,才能結(jié)合到互補DNA的靶序列上,從而替換延伸的5端產(chǎn)物。如此經(jīng)過RNA降解、新引物結(jié)合、鏈置換的這一循環(huán)過程,實現(xiàn)模板互補序列的快速擴增。

        SPIA是首個用于全球基因組DNA擴增的方法,此法也可用于特定基因組序列和合成DNA序列的擴增[20]。SPIA通過加入一種轉(zhuǎn)錄酶改良為Ribo-SPIA,后者也可用于全球及特定RNA的擴增[21]。由于Ribo-SPIA只擴增原始的轉(zhuǎn)錄本,而非復(fù)制產(chǎn)物,所以其具有高度的保度,而且其能放大每個RNA原始轉(zhuǎn)錄本高達1萬倍。因此,SPIA可用于不同種類核酸的大量擴增,在臨床研究中也常見[22]。

        2.6 交叉引物等溫擴增 交叉引物等溫擴增技術(shù)(crossing priming amplification,CPA)及其擴增機制是由杭州優(yōu)思達公司于2012年提出[23]。CPA的擴增過程包括:帶有交叉引物位點的擴增產(chǎn)物的產(chǎn)生、交叉引物的擴增、產(chǎn)物的產(chǎn)生。在擴增過程中,Bst DNA聚合酶通過置換作用不斷延伸交叉引物及置換引物,而產(chǎn)生固定的正向鏈5端。同時,在擴增中引物不斷地雜交、延伸及擴增產(chǎn)物的自我雜交、延伸,而產(chǎn)生多個引物雜交位點從而加速整個擴增過程,擴增的終產(chǎn)物是單鏈、發(fā)夾樣結(jié)構(gòu)、雙鏈DNA的混合物。

        CPA廣泛應(yīng)用于分子診斷、檢驗檢疫、生物醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域,但主要還是集中在引起人類疾病的病原微生物、食物中致病微生物的核酸檢測及人類遺傳性疾病相關(guān)基因的診斷上。祁軍等[24]應(yīng)用CPA法檢測沙門菌、志賀菌及瘧疾等病原體。有學(xué)者建立了應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因生物檢測上的CPA擴增法[25]。

        2.7 新型等溫多自配引發(fā)擴增技術(shù) 新型等溫多自配引發(fā)擴增技術(shù)(isothermal multiple self-matching-initiated amplification,IMSA)是中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所于2013年研發(fā)并申請專利的一種新型核酸恒溫擴增技術(shù)。IMSA利用6條引物特異性識別靶基因的7個位點,其擴增包括原始自我配對結(jié)構(gòu)(SMS)的生成、基于SMA的自我循環(huán)擴增及最終形成的基于原始SMA衍生的長鏈C環(huán)樣DNA雙鏈結(jié)構(gòu)或正在解鏈的C環(huán)樣結(jié)構(gòu)。IMSA在擴增過程中會產(chǎn)生多倍數(shù)的能自我配對繼而引發(fā)循環(huán)擴增的寡核苷酸結(jié)構(gòu),使得隨后循環(huán)擴增幾率明顯增加,繼而使得擴增效率和檢測靈敏度提升。目前IMSA的應(yīng)用還比較局限,Ding等[26]建立了人類腸道病毒71(EV71)及柯薩奇病毒A16(CVA16)的IMSA擴增法,其具有高特異性及高靈敏度(EV71靈敏度高達96.4%,CVA16靈敏度達94.6%,),靈敏度比LAMP法的還要高(EV71靈敏度91.1%,CVA16靈敏度90.8%)。且該法亦無需熱循環(huán)儀,操作簡便、快速,具有很好的應(yīng)用前景,值得引起重視。

        3 展望

        伴隨著高效的擴增,等溫核酸擴增技術(shù)可以作為便攜式分子診斷發(fā)展的理想候選技術(shù)。在過去的20年里,等溫核酸擴增技術(shù)有著顯著的進步。盡管目前PCR仍然是用于核酸擴增最為廣泛的技術(shù),但由于其需要熱循環(huán)擴增儀及復(fù)雜的擴增程序,這些不足造成PCR實地應(yīng)用困難并導(dǎo)致篩查成本的增加。相比之下,等溫擴增技術(shù)對于原始生物樣本的應(yīng)用范圍更寬,在臨床診斷的效能上兩者相當(dāng)或者說等溫擴增技術(shù)更優(yōu)于PCR技術(shù)。等溫擴增技術(shù)的優(yōu)點還有,從樣本的處理到后續(xù)的檢測,等溫擴增技術(shù)只需在一個小管里便可進行,以及其檢測只需微量樣本、檢測快速。

        一些等溫擴增技術(shù)已被發(fā)展成為商業(yè)產(chǎn)品,如NASBA、SDA、LAMP、SPIA等。盡管等溫擴增技術(shù)已經(jīng)被證實應(yīng)用于分子診斷上以及被商品化了,但其廣泛應(yīng)用,尤其是商業(yè)產(chǎn)品的廣泛使用卻未實現(xiàn),這其中最大的障礙并非缺乏適當(dāng)?shù)牡葴財U增技術(shù),而是其具體技術(shù)細節(jié)的復(fù)雜性和成熟度(包括專利保護和推廣應(yīng)用之間的矛盾問題)。因此,在未來生物分析體系的發(fā)展里,等溫核酸擴增技術(shù)有著重大的機遇??偟膩碚f,鑒于其簡便性、高效能擴增以及小型化及自動化的高度適應(yīng)性這些優(yōu)勢,等溫核酸擴增技術(shù)在不久的將來會在分子診斷方面普及應(yīng)用,尤其是在床旁及實地篩查檢測的應(yīng)用。

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        (收稿日期:2017-03-15) (本文編輯:周亞杰)

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