劉廣昌　陳紅艷　楊永平　嚴(yán)海超　郭健　羅罡　劉鳳玲

【摘要】 目的：利用雙向熒光差異凝膠電泳-質(zhì)譜分析技術(shù)，研究廣東省原住口腔扁平苔蘚患者非刺激全唾液蛋白豐度變化。方法：選取本院2016年1-12月收治的15例口腔扁平苔蘚患者為研究組，15例正常者為對(duì)照組，收集兩組患者的唾液，提取唾液的總蛋白，通過(guò)雙向熒光差異凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，熒光掃描尋找差異蛋白質(zhì)，利用質(zhì)譜分析技術(shù)對(duì)差異蛋白質(zhì)進(jìn)行分析。結(jié)果：SDS-PAGE顯示所有樣品的蛋白條帶清晰，無(wú)空缺條帶，無(wú)明顯蛋白丟失現(xiàn)象。經(jīng)2-D DIGE分離檢測(cè)，兩組唾液蛋白樣品的總蛋白整體分布相似，重復(fù)性較好，研究組與對(duì)照組平均唾液蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)分別為（1596±207）個(gè)和（1603±164）個(gè)。質(zhì)譜分析鑒定兩組唾液蛋白存在五個(gè)差異比較明顯的蛋白質(zhì)，即分泌性IgA、鋅α2糖蛋白、碳酸酐酶6、唾液淀粉酶和血清白蛋白，且研究組唾液蛋白中分泌性IgA表達(dá)下調(diào)，其余四種差異蛋白均表達(dá)上調(diào)（P<0.01）。結(jié)論：分泌性IgA、鋅α2糖蛋白、碳酸酐酶6、唾液淀粉酶和血清白蛋白五種差異蛋白，可能與口腔扁平苔蘚的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)，可為今后的藥物選擇與治療方案制定提供依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】 口腔扁平苔蘚； 唾液蛋白； 雙向熒光差異凝膠電泳； 質(zhì)譜分析

Non-stimulated Total Salivary Proteomics of Oral Lichen Planus in Guangdong Province/LIU Guang-chang，CHEN Hong-yan，YANG Yong-ping，et al//Medical Innovation of China，2017，14（16）：128-131

【Abstract】 Objective：To study the abundance change of non-stimulated total salivary protein in oral lichen planus patients in Guangdong province by two dimensional fluorescence difference gel electrophoresis（2-D DIGE）-mass spectrometry.Method：From July 2016 to December 2016，15 patients with oral lichen planus in our hospital were selected as the study group，15 normal subjects were selected as the control group. Saliva of the two groups was collected for the study.The total proteins of saliva were extracted and the proteins were separated by two-dimensional fluorescence differential gel electrophoresis.The differential proteins were detected by fluorescence scanning，and the differential proteins were analyzed by mass spectrometry.Result：SDS-PAGE showed that the protein bands of all the samples were clear and there was no vacancy band and no protein loss.The total protein distribution of the salivary protein samples was similar and reproducible by 2-D DIGE.The average number of salivary protein spots in the study group and control group were （1596±207） and （1603±164）cases respectively.Mass spectrometry analysis showed that there were five significant differences in salivary proteins，secreted IgA，zinc α-2-glycoprotein，carbonic anhydrase 6，salivary amylase and serum albumin.The expression of secretory IgA in the saliva protein of the study group was down-regulated， and the other four proteins were all up-regulated（P<0.01）.Conclusion：Five differentially expressed proteins，incliuding secretory IgA，zinc α-2-glycoprotein， carbonic anhydrase 6，salivary amylase and serum albumin，may be closely related to the development and progression of oral lichen planus，which can provide basis for future drug selection and treatment plan.

【Key words】 Oral lichen planus； Salivary protein； Two dimensional fluorescence difference gel electrophoresis（2D-DIGE）； Mass spectrometry

First-authors address：Dalang Hospital of Dongguan，Dongguan 523770，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.16.037

口腔扁平苔蘚（OLP）是臨床上一種常見(jiàn)的慢性口腔黏膜病，30～60歲為好發(fā)年齡，兒童和老人少見(jiàn)，女性略多于男性[1]。OLP可長(zhǎng)期反復(fù)發(fā)作，因長(zhǎng)期糜爛病損易導(dǎo)致癌變，世界衛(wèi)生組織將其列入癌前狀態(tài)[2]。OLP目前發(fā)病機(jī)制尚不明確，臨床尚無(wú)特別有效的治療方法。雙向熒光差異凝膠電泳（2D-DIGE）技術(shù)，是利用電荷和分子量的差異分離蛋白質(zhì)混合物，并通過(guò)多通道激光掃描分析不同蛋白質(zhì)的第二向SDS-PAGE凝膠圖像[3-4]。與以往的雙向電泳技術(shù)相比，重復(fù)性好，靈敏度高。本研究采用雙向熒光差異凝膠電泳-質(zhì)譜分析技術(shù)，通過(guò)對(duì)本地區(qū)口腔扁平苔蘚患者唾液蛋白的篩選找出差異蛋白，為進(jìn)一步研究本地區(qū)OLP的發(fā)病機(jī)制提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取本院2016年1月-2016年12月收治的15例口腔扁平苔蘚患者為研究組，15例正常者為對(duì)照組，收集兩組患者的非刺激性全唾液（whole nnstimulated saliva，WUS）。其中研究組男6例，女9例，平均年齡（42.5±3.4）歲。對(duì)照組男7例，女8例，平均年齡（43.1±2.6）歲。兩組患者一般資料比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。該研究已經(jīng)醫(yī)院倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)，入選患者知情同意。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 兩組入選成員均為廣東省原住人口；均全身無(wú)系統(tǒng)性疾??；口腔內(nèi)均無(wú)其他黏膜病變及中、重度牙周炎；婦女均未處于懷孕期及哺乳期；半年內(nèi)未做過(guò)牙周基礎(chǔ)治療；最近3個(gè)月均未服用過(guò)抗生素；均全口無(wú)齲者；均無(wú)抽煙者。

1.3 方法

1.3.1 儀器設(shè)備 Ettan等電聚焦電泳儀、Ettan垂直板電泳儀、MultiTem P Ⅲ溫控循環(huán)水浴、Typhoon 9400多功能熒光掃描系統(tǒng)、Image Quant圖像分析軟件、Decyder Differentialin-gel Analysis V ersion 7.0凝膠分析軟件均為GEHealthcare 公司產(chǎn)品，4800 M ALDI-TOF/TOF質(zhì)譜為Applied Biosystem 公司產(chǎn)品

1.3.2 樣本的采集 OLP患者在采集前一天晚餐清淡飲食，睡前采用Bass刷牙法進(jìn)行口腔護(hù)理。所有成員均按照Rhodus改良的方法，采集WUS 3 mL置于無(wú)菌試管。收集所有樣品后，吸取唾液上清液加入離心管中，隨后加入新鮮配制50%胎牛血清白，迅速用封口膜密封，快速放入-80 ℃超低溫冰箱中冷凍、備用。

1.3.3 樣本的處理 將樣本進(jìn)行裂解、離心，并取上清液。得到蛋白溶液經(jīng)2D-Clean up試劑盒純化后用2D-Q uant試劑盒進(jìn)行定量。每樣品各取50 μg蛋白質(zhì)，按照CyDye DIGE Fluor minimal labeling kit試劑盒使用說(shuō)明進(jìn)行熒光標(biāo)記。

1.3.4 雙向電泳（全程避光） 將用Cy2、Cy3和Cy5標(biāo)記的樣品混合在一支離心管，加入等體積的2×sample buffer，用移液器吸打混勻后避光、冰上放置10 min。加入一向電泳水化液至450 L，混勻。將上述溶液加入Holder中，小心置入24 cm膠條（pH 3～11），用覆蓋油覆蓋。等電聚焦參數(shù)設(shè)定為：30 V，12 h；100 V，1 h；1000 V，1 h；梯度升壓至8000 V，2 h；電流控制在50 μA/膠條。等點(diǎn)聚焦后在平衡液1和平衡液2中各平衡15 min。用電泳液輕輕潤(rùn)洗膠條。然后轉(zhuǎn)移到第二向已制好的12.5% SDS-PAG E膠上，用0.5%瓊脂糖封頂，進(jìn)行第二向電泳，二向電泳的參數(shù)設(shè)定為：3 W/膠條，45 min；17 W/膠條至溴酚藍(lán)染料遷移至膠的底部結(jié)束電泳。

1.3.5 圖像掃描 用Typhoon 9400熒光掃描儀分別采集Cy2、Cy3和Cy5熒光信號(hào)。通過(guò)調(diào)整PM T，使選定的強(qiáng)信號(hào)區(qū)域熒光強(qiáng)度在60000～100000并盡量接近，平衡熒光信號(hào)。所得圖像用Decyder Differentialin-gel Analysis Version 7.0凝膠分析軟件進(jìn)行差異蛋白分析。

1.3.6 質(zhì)譜分析 考馬斯亮藍(lán)后挖取感興趣的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)置于離心管中，進(jìn)一步用胰蛋白酶降解，進(jìn)行MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜分析，通過(guò)Mascot數(shù)據(jù)搜索鑒定蛋白質(zhì)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用 字2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組SDS-PAGE蛋白條帶比較 SDS-PAGE結(jié)果顯示，所有樣本的蛋白條帶清晰，兩組間蛋白條帶重復(fù)性較好，并無(wú)明顯蛋白丟失現(xiàn)象。

2.2 兩組2-D DIGE結(jié)果比較 經(jīng)2-D DIGE檢測(cè)兩組總蛋白整體分布相似，圖像重復(fù)性較好、分辨率比較高，研究組與對(duì)照組平均蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)分別為（1596±207）個(gè)和（1603±164）個(gè)。

2.3 兩組質(zhì)譜分析鑒定結(jié)果 質(zhì)譜分析結(jié)果顯示，兩組唾液蛋白存在五個(gè)差異明顯的蛋白質(zhì)，即分泌性IgA、鋅α2糖蛋白、碳酸酐酶6、唾液淀粉酶和血清白蛋白，研究組中分泌性IgA表達(dá)下調(diào)，其余四種差異蛋白表達(dá)明顯上調(diào)（P<0.01），見(jiàn)表1。

3 討論

口腔扁平苔蘚（OLP）在口腔疾病中比較常見(jiàn)，主要的臨床表現(xiàn)為乳白色斑點(diǎn)，斑細(xì)小孤立，排列成環(huán)狀、線狀及不規(guī)則的網(wǎng)狀，也有些患者出現(xiàn)斑塊、萎縮、丘疹、侵蝕性潰瘍和大皰[5]。目前其發(fā)病機(jī)制仍不明確，有自身免疫、感染、神經(jīng)精神因素、細(xì)胞因子作用、家族遺傳等學(xué)說(shuō)，也有些人認(rèn)為藥物因素、內(nèi)分泌異常、慢性病灶等因素也可誘發(fā)本病[6-7]。隨著以蛋白質(zhì)組學(xué)研究為主的后基因組時(shí)代的來(lái)臨，人們開始從蛋白質(zhì)組學(xué)的角度研究疾病的發(fā)生機(jī)制[8]。通過(guò)差異蛋白質(zhì)來(lái)研究OLP，將更加全面地揭示其發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的重要蛋白質(zhì)，為深入探討OLP發(fā)生機(jī)制及臨床診治提供有效信息。

蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)迅速發(fā)展，2-D DIGE的出現(xiàn)有效地克服了傳統(tǒng)2-DE技術(shù)的弊端，分辨率高，重復(fù)性好，減少實(shí)驗(yàn)誤差帶來(lái)的影響，使用熒光染料共價(jià)標(biāo)記，可分析微量的蛋白質(zhì)樣品，靈敏度高[9-10]。唾液中既包含了血液中可以被常規(guī)檢測(cè)到的所有蛋白、激素、抗體和其他分子標(biāo)記，還包括許多唾液腺分泌的蛋白質(zhì)等，可反映身體的健康狀態(tài)[11]。OLP的發(fā)生會(huì)導(dǎo)致唾液中的蛋白質(zhì)組分發(fā)生變化，因此準(zhǔn)確全面地檢測(cè)患者唾液的蛋白組分表達(dá)水平尋找出差異蛋白，對(duì)于進(jìn)一步闡明OLP發(fā)病機(jī)制具有十分重要的意義。且唾液檢查無(wú)創(chuàng)傷，簡(jiǎn)單方便，患者易于接受。本研究利用雙向熒光差異凝膠電泳-質(zhì)譜分析技術(shù)，成功篩選并鑒定出OLP患者唾液蛋白中存在分泌性IgA、鋅α2糖蛋白、碳酸酐酶6、唾液淀粉酶和血清白蛋白五種差異蛋白質(zhì)。

分泌性IgA在唾液中含量較高，與口腔的生理活動(dòng)功能密切相關(guān)，許彥枝等[12]發(fā)現(xiàn)，OLP患者唾液蛋白中的分泌性IgA含量明顯降低。本研究中研究組唾液蛋白中分泌性IgA含量明顯低于對(duì)照組，與之前的相關(guān)報(bào)道保持一致，具有臨床意義。這可能是由于當(dāng)口腔腺體及其周圍黏膜合成和分泌分泌性IgA不足時(shí)，唾液中分泌性IgA含量降低，病原體易侵入口腔引起感染[13]。鋅α2糖蛋白作為一種脂解因子，可以促進(jìn)脂肪細(xì)胞的脂質(zhì)分解，在惡性腫瘤病人體內(nèi)表達(dá)明顯增高，特別是惡病質(zhì)患者[14]。除了血清和精液，在尿液、唾液、汗液等體液中都能檢測(cè)到這種蛋白[15]。本研究中鋅α2糖蛋白在OLP患者唾液蛋白中表達(dá)上調(diào)，具體的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

碳酸酐酶6具有維持口腔環(huán)境pH值平衡的功能[16]。研究發(fā)現(xiàn)唾液碳酸酐酶6減少時(shí)，齲齒發(fā)生率增加。本研究中OLP患者唾液蛋白中碳酸酐酶6增加，可能與口腔內(nèi)細(xì)菌繁殖導(dǎo)致產(chǎn)酸增高有關(guān)。近年來(lái)，唾液淀粉酶活性檢測(cè)的有效性逐漸得到認(rèn)可，已經(jīng)成為一種反映人體自主神經(jīng)系統(tǒng)在壓力及壓力相關(guān)刺激下發(fā)生變化最為敏感的生物標(biāo)記物[17]。在高度精神集中運(yùn)算壓力下，健康人群的唾液淀粉酶分泌會(huì)明顯增加。焦慮患者唾液中的唾液淀粉酶活性與焦慮程度明顯正相關(guān)[18]。長(zhǎng)期的神經(jīng)情緒緊張焦慮，很有可能誘發(fā)OLP，從而引起唾液淀粉酶含量的增加。唾液中的白蛋白主要來(lái)自血液，武影[19]等研究發(fā)現(xiàn)血清白蛋白在慢性牙周炎患者WUS中的表達(dá)上調(diào)。這主要是全唾液中含有10%來(lái)源的齦溝液成分，在牙周組織炎癥狀態(tài)下齦溝液流量增大，進(jìn)入唾液的成分也可能增高[20]。本研究中研究組血清白蛋白表達(dá)上調(diào)，可能是由于OLP是一種慢性炎癥性疾病，對(duì)局部黏膜產(chǎn)生的刺激影響唾液的分泌，誘發(fā)血清白蛋白含量增多所致。

綜上所述，利用雙向熒光差異凝膠電泳-質(zhì)譜分析技術(shù)，篩選出OLP患者唾液蛋白存在的五種差異蛋白，但仍需要通過(guò)Western blot等技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究將繼續(xù)探索本地區(qū)扁平苔蘚患者唾液中蛋白質(zhì)的代謝變化規(guī)律與發(fā)病機(jī)制，努力為臨床診療提供依據(jù)。

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（收稿日期：2016-12-30） （本文編輯：周亞杰）