李秀男, 牛子琪, 胡衛(wèi)成,2,3, 王新風(fēng),2,4

(1.淮陰師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院, 江蘇 淮安 223300; 2.淮安市食品組分與功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 江蘇 淮安 223300; 3.江蘇省區(qū)域農(nóng)業(yè)與環(huán)境保護(hù)協(xié)同創(chuàng)新中心, 江蘇 淮安 223300;4.江蘇省生物質(zhì)能與酶技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 江蘇 淮安 223300)

密孔菌固態(tài)發(fā)酵農(nóng)業(yè)廢棄物產(chǎn)漆酶活性的研究

李秀男1, 牛子琪1, 胡衛(wèi)成1,2,3, 王新風(fēng)1,2,4

(1.淮陰師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院, 江蘇 淮安 223300; 2.淮安市食品組分與功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 江蘇 淮安 223300; 3.江蘇省區(qū)域農(nóng)業(yè)與環(huán)境保護(hù)協(xié)同創(chuàng)新中心, 江蘇 淮安 223300;4.江蘇省生物質(zhì)能與酶技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 江蘇 淮安 223300)

分別以玉米秸稈、小麥秸稈和楊樹木屑為原料,研究了一株密孔菌在發(fā)酵不同農(nóng)業(yè)廢棄物時(shí)漆酶的活性．結(jié)果表明,農(nóng)業(yè)廢棄物對(duì)密孔菌產(chǎn)漆酶具有良好的誘導(dǎo)效果,且以玉米秸稈的效果最佳,漆酶酶活可達(dá)40.92 U·mg-1．Cu2+的存在或濃度變化顯著影響密孔菌產(chǎn)酶,當(dāng)添加0.02% Cu2+時(shí),菌株在小麥秸稈和木屑培養(yǎng)基上產(chǎn)酶活分別達(dá)到41.24 U·mg-1和57.13 U·mg-1;當(dāng)Cu2+濃度為0.04%時(shí),菌株在玉米秸稈培養(yǎng)基上分泌漆酶酶活達(dá)到峰值94.92 U·mg-1．pH值對(duì)密孔菌產(chǎn)漆酶有明顯影響,在中酸性環(huán)境中菌株產(chǎn)漆酶酶活較高．菌株在小麥秸稈和玉米秸稈培養(yǎng)基上發(fā)酵產(chǎn)酶的最適溫度較高,分別為35℃和40℃,且在整個(gè)發(fā)酵周期能維持較高較穩(wěn)定的酶活水平．因此,密孔菌有很好產(chǎn)漆酶和降解農(nóng)作物秸稈的能力,可用于農(nóng)作物秸稈處理．

密孔菌; 固態(tài)發(fā)酵; 農(nóng)業(yè)廢棄物; 漆酶

0 引言

漆酶是一類含銅多酚氧化酶,廣泛存在于高等植物和真菌體內(nèi)[1]．目前已知真菌類的擔(dān)子菌、子囊菌和半知菌大多都具有產(chǎn)漆酶能力,其中具有降解木質(zhì)素能力的白腐菌是主要的漆酶產(chǎn)生菌[2]．在過(guò)去的幾十年中,人們發(fā)現(xiàn)漆酶具有廣泛的底物特異性,可以氧化酚類、芳胺類、羧酸類、甾體激素與生物色素、金屬有機(jī)化合物和一些非酚類物質(zhì),且副產(chǎn)物只有水,被譽(yù)為“綠色酶”．漆酶不僅在生物制漿、生物漂白以及有毒化合物的降解等方面有重要的應(yīng)用前景,而且在合成工業(yè)、生物檢測(cè)、染料降解等方面也具有潛在的應(yīng)用前景[3-5]．它們的應(yīng)用從紡織到紙漿和造紙工業(yè)[6-7],從食品[8]到有機(jī)合成[9]和制藥工業(yè)[10],從生物降解到環(huán)境保護(hù)和生態(tài)修復(fù)[11-13]等多個(gè)領(lǐng)域越來(lái)越廣泛,隨著人們對(duì)漆酶作用機(jī)理的深入了解,以及對(duì)白腐真菌這一降解木質(zhì)素明星微生物的研究,利用白腐真菌來(lái)處理農(nóng)業(yè)廢棄物的研究也就走進(jìn)了研究者的視線．

目前,我國(guó)已成為世界上農(nóng)業(yè)廢棄物產(chǎn)出量最大的國(guó)家,其中農(nóng)作物秸稈年產(chǎn)量達(dá)7億噸(干質(zhì)量),畜禽糞便排放量30多億噸,鋸末、刨花等林業(yè)廢棄物16 000噸[14]．在我國(guó)各地政府部門的大力倡導(dǎo)下,作為主要農(nóng)業(yè)廢棄物的秸稈大多以直接還田的方式行處理,如江蘇省淮安市秸稈年產(chǎn)量達(dá)420萬(wàn)噸,其中夏季所產(chǎn)的秸稈還田量可達(dá)95%．秸稈還田的過(guò)程也是微生物降解的過(guò)程,農(nóng)業(yè)廢棄物是一種富含木質(zhì)素資源(如稻草中含木質(zhì)素10%～15%,纖維素35%～40%和半纖維素25%～30%),也是一種天然的漆酶誘導(dǎo)劑[15]．本文將討論一株密孔菌(Pycnoporuscoccineus)在發(fā)酵不同農(nóng)業(yè)廢棄物時(shí)漆酶的活性變化情況,旨在為加強(qiáng)農(nóng)業(yè)廢棄物的綜合利用和對(duì)農(nóng)業(yè)面源污染的綜合治理尋找理論依據(jù)．

1 材料方法

1.1 菌種

緋紅密孔菌(Pycnoporuscoccineus),采自江蘇省溧陽(yáng)市天目湖南山竹海翠谷莊園板栗林,本實(shí)驗(yàn)室保存．

1.2 試劑和儀器

2,2-連氮-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS),美國(guó)Sigma 公司產(chǎn)品;考馬斯亮藍(lán)G250和牛血清蛋白,Amresco分裝;冰乙酸,無(wú)水乙酸鈉為市售分析純．

T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì)(北京普析)．

1.3 培養(yǎng)基

母種活化培養(yǎng)基: PDA固體培養(yǎng)基．

液體種子培養(yǎng)基: 土豆200 g,葡萄糖20 g,酵母膏5 g,自來(lái)水1000 mL．

固體發(fā)酵培養(yǎng)基: 楊樹木屑、玉米秸稈、小麥秸稈分別輕度粉碎,按每種基質(zhì)的總質(zhì)量加入2%蔗糖、1% Ca(OH)2、1% KH2PO4、0.5% MgSO4、0.5%酵母膏、2%石膏、10 mg·L-1VB,以最終培養(yǎng)基含水量為65%為標(biāo)準(zhǔn)加入適量自來(lái)水,反復(fù)搓揉均勻,用塑料薄膜蓋2 h．

銅離子濃度試驗(yàn)培養(yǎng)基: 在固體發(fā)酵培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加入CuSO4·5H2O,調(diào)整培養(yǎng)基中銅離子濃度分別為(0.01%、0.02%、0.03%、0.04%),以未加CuSO4·5H2O的培養(yǎng)基為空白對(duì)照考察銅離子濃度對(duì)緋紅密孔菌產(chǎn)漆酶的影響．

pH試驗(yàn)培養(yǎng)基: 根據(jù)試驗(yàn)培養(yǎng)基計(jì)算所需自來(lái)水體積,將除石膏外的各試劑溶于定量自來(lái)水中,用檸檬酸和Na2CO3分別調(diào)節(jié)pH為3.0，5.0，7.0，9.0，11.0,加入石膏,均勻拌入固體基質(zhì)中．考察發(fā)酵料初始pH對(duì)緋紅密孔菌產(chǎn)漆酶的影響．

溫度試驗(yàn)培養(yǎng)基: 在固體發(fā)酵培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加入適量的CuSO4·5H2O,分別置于不同溫度下(20℃，25℃，30℃，35℃，40℃)培養(yǎng),考察培養(yǎng)溫度對(duì)緋紅密孔菌產(chǎn)漆酶的影響．

1.4 方法

1.4.1 發(fā)酵培養(yǎng)

將活化后的母種,接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基,25℃,120 r·min-1恒溫振蕩,避光培養(yǎng)5 d后,得到液體菌種．配制固體培養(yǎng)基,按每罐10 g基質(zhì)(小麥秸稈、玉米秸稈或木屑)分裝于玻璃罐頭瓶中,每罐發(fā)酵料終體積約占1/3．將液體菌種接種于不同配方的固體培養(yǎng)基上,適宜溫度下恒溫避光培養(yǎng)．

1.4.2 粗酶液獲取

在無(wú)菌條件下, 隨機(jī)選擇生長(zhǎng)狀態(tài)一致的菌絲體培養(yǎng)料1 g, 置于加入15 mL醋酸緩沖液(0.2 mol·L-1,pH 4.5)的100 mL三角瓶中,25℃,120 rpm的搖床中浸提2 h,4 000 r·min-1離心10 min后取上清液,即為粗酶液．

1.4.3 可溶性蛋白測(cè)定

采用考馬斯亮藍(lán)G250法[16]．蛋白濃度在20 ～80μg·mL-1之間,蛋白含量與吸光度值呈很好的線性關(guān)系,兩者間的回歸方程為:y=0.0062x+0.0081,相關(guān)系數(shù)r=0.9981．

1.4.4 酶活測(cè)定方法

漆酶活力的測(cè)定采用ABTS法[1],以2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)為底物,量取2 mL ABTS,將3.2 mL pH 4.5的醋酸緩沖液和0.8 mL稀釋好的粗酶液混合,使反應(yīng)總體積為6 mL．測(cè)定反應(yīng)前3 min內(nèi)420 nm 處每30 s吸光值的變化,酶活定義為粗酶液中每mg蛋白每分鐘引起吸光度增加0.1所需要的酶量，單位為U·mg-1．酶活計(jì)算公式:

其中，V酶為添加酶液體積(mL);n為蛋白含量(μg·mL-1).

2 結(jié)果

2.1 農(nóng)業(yè)廢棄物對(duì)密孔菌漆酶活性的影響

如表1所示,密孔菌在玉米秸稈培養(yǎng)基上產(chǎn)酶酶活最高,在培養(yǎng)的第11 d,漆酶酶活達(dá)到峰值40.92 U·mg-1．而菌株在小麥秸稈和木屑培養(yǎng)基上產(chǎn)酶酶活最大值相差不多,分別為12.33 U·mg-1和11.18 U·mg-1．這可能是由于廢棄物的種類或所取廢棄物的部位不同,而導(dǎo)致各發(fā)酵培養(yǎng)基中纖維素、半纖維素、木質(zhì)素含量不同造成的結(jié)果[17]．

表1 農(nóng)業(yè)廢棄物對(duì)密孔菌產(chǎn)酶活性的影響 (U·mg-1)

2.2 Cu2+對(duì)密孔菌漆酶活性的影響

漆酶作為一種含銅的多酚氧化酶,屬于藍(lán)色多銅氧化酶[18]．它的活性位點(diǎn)主要由4個(gè)3種不同類型的銅離子組成,因此銅離子是漆酶分泌的一個(gè)重要影響因素[19]．本實(shí)驗(yàn)通過(guò)改變產(chǎn)酶培養(yǎng)基中Cu2+濃度,研究其對(duì)漆酶產(chǎn)量的影響．結(jié)果如表2～表4所示．

表2 小麥秸稈培養(yǎng)基上Cu2+對(duì)密孔菌產(chǎn)酶活性的影響 (U·mg-1)

表3 玉米秸稈培養(yǎng)基上Cu2+對(duì)密孔菌產(chǎn)酶活性的影響 (U·mg-1)

表4 木屑培養(yǎng)基上Cu2+對(duì)密孔菌產(chǎn)酶活性的影響 (U·mg-1)

結(jié)果表明,在以不同農(nóng)業(yè)廢棄物為主料的培養(yǎng)基上,Cu2+對(duì)密孔菌產(chǎn)酶活性的影響也不相同．對(duì)于小麥秸稈,當(dāng)Cu2+濃度為0.02%時(shí),菌株產(chǎn)漆酶酶活最高,為41.24 U·mg-1．對(duì)于玉米秸稈,當(dāng)Cu2+濃度為0.04%時(shí),菌株分泌漆酶酶活達(dá)到峰值94.92 U·mg-1．在培養(yǎng)初期,添加Cu2+的培養(yǎng)基產(chǎn)酶酶活低于空白培養(yǎng)基,而隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加,Cu2+對(duì)菌株分泌漆酶的促進(jìn)作用逐漸表現(xiàn)出來(lái);而木屑培養(yǎng)基中,Cu2+濃度為0.02%時(shí),菌株產(chǎn)漆酶酶活最高,達(dá)到57.13 U·mg-1．并且在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中,添加0.02%和0.03%濃度Cu2+的培養(yǎng)基產(chǎn)漆酶酶活均高于空白培養(yǎng)基,Cu2+對(duì)菌株產(chǎn)漆酶的促進(jìn)作用十分顯著．過(guò)高或過(guò)低濃度的銅離子都不利于漆酶的分泌．

2.3 發(fā)酵料初始pH對(duì)密孔菌漆酶活性的影響

研究表明,漆酶合成與活力表達(dá)受環(huán)境pH影響顯著[20-21]．本實(shí)驗(yàn)調(diào)整3種發(fā)酵料不同初始pH值,考察其對(duì)密孔菌產(chǎn)酶活性的影響．實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表5～表7所示．

表5 小麥秸稈培養(yǎng)基上發(fā)酵料初始pH對(duì)密孔菌產(chǎn)酶活性的影響 (U·mg-1)

表6 玉米秸稈培養(yǎng)基上發(fā)酵料初始pH對(duì)密孔菌產(chǎn)酶活性的影響 (U·mg-1)

表7 木屑培養(yǎng)基上發(fā)酵料初始pH對(duì)密孔菌產(chǎn)酶活性的影響 (U·mg-1)

結(jié)果顯示,菌株在中酸性條件下分泌漆酶酶活較高,而在堿性環(huán)境中產(chǎn)酶酶活極低甚至檢測(cè)不出．此外,菌株在不同培養(yǎng)基上產(chǎn)酶所需最適pH也存在差異．對(duì)于小麥秸稈和玉米秸稈培養(yǎng)基,菌株在偏中性環(huán)境中產(chǎn)酶酶活較高,分別在初始pH為7和5時(shí)達(dá)到酶活峰值45.79 U·mg-1和59.77 U·mg-1;而在木屑培養(yǎng)基中,菌株更適宜在偏酸性環(huán)境中生長(zhǎng),在初始pH值為3時(shí)酶活最高,為86.14 U·mg-1,且出現(xiàn)的時(shí)間晚于小麥秸稈和玉米秸稈．有研究表明,真菌在中偏酸性環(huán)境下酶活較高,這與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果基本一致[22]．尹艷麗等[23]認(rèn)為偏酸性條件,一方面會(huì)促進(jìn)白腐菌生長(zhǎng),另一方面,由于漆酶的最適作用pH為酸性,因而能使白腐菌分泌的漆酶保持較高活性．

2.4 培養(yǎng)溫度對(duì)密孔菌漆酶活性的影響

微生物的生命活動(dòng)都是由一系列的生化反應(yīng)組成的,這些反應(yīng)受溫度影響極其明顯,所以溫度是影響微生物生長(zhǎng)繁殖的重要因素之一[24]．本實(shí)驗(yàn)設(shè)置不同的培養(yǎng)溫度,考察其對(duì)密孔菌產(chǎn)酶活性的影響．實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表8～表10所示．

表8 小麥秸稈培養(yǎng)基上培養(yǎng)溫度對(duì)密孔菌產(chǎn)酶活性的影響 (U·mg-1)

表9 玉米秸稈培養(yǎng)基上培養(yǎng)溫度對(duì)密孔菌產(chǎn)酶活性的影響 (U·mg-1)

表10 木屑培養(yǎng)基上培養(yǎng)溫度對(duì)密孔菌產(chǎn)酶活性的影響 (U·mg-1)

結(jié)果顯示,培養(yǎng)溫度對(duì)密孔菌產(chǎn)酶酶活具有較大的影響．菌株在以不同農(nóng)業(yè)廢棄物為主料的培養(yǎng)基上所需的最適溫度也不同．在小麥秸稈培養(yǎng)基上,當(dāng)培養(yǎng)溫度為35℃時(shí),在培養(yǎng)的第4 d,酶活達(dá)到最大值65.07 U·mg-1．但隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加,酶活下降非常迅速．而當(dāng)培養(yǎng)溫度為40℃時(shí),在整個(gè)培養(yǎng)周期內(nèi),酶活均能穩(wěn)定維持在20 U·mg-1上下．在玉米秸稈培養(yǎng)基上,當(dāng)培養(yǎng)溫度為40℃時(shí),在培養(yǎng)的第12 d,菌株產(chǎn)酶酶活達(dá)到峰值34.80 U·mg-1,整個(gè)培養(yǎng)周期內(nèi),菌株都能維持較高的酶活．實(shí)驗(yàn)中我們還發(fā)現(xiàn),40℃高溫條件下,菌絲體生長(zhǎng)狀況欠佳,因此我們認(rèn)為密孔菌產(chǎn)的漆酶在較高的溫度下活性會(huì)增強(qiáng)．在木屑培養(yǎng)基上,當(dāng)培養(yǎng)溫度為25℃時(shí),菌絲生長(zhǎng)至12～14 d,酶活達(dá)到16～17 U·mg-1,且在此溫度下,菌絲生長(zhǎng)茂密．在高于25℃溫度條件下,反應(yīng)體系中的酶活最大值均出現(xiàn)提早,并且最大酶活較低．這可能因?yàn)槟拘寂囵B(yǎng)料透氣性和保水性都較差,較高溫度會(huì)導(dǎo)致濕度下降,不利于其發(fā)酵．相比于小麥秸稈和玉米秸稈培養(yǎng)基,木屑酶活最大值出現(xiàn)的時(shí)間較晚,這可能與木屑培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分與前兩者不同,菌株在其上生長(zhǎng)較慢有關(guān)．并且在40℃培養(yǎng)條件下,菌株在木屑培養(yǎng)基上產(chǎn)酶酶活低于小麥和玉米秸稈培養(yǎng)基,這可能與木屑保水性較差有關(guān)．

3 討論

農(nóng)作物秸稈等廢棄物對(duì)密孔菌產(chǎn)漆酶具有良好的誘導(dǎo)效果,主要是因?yàn)榘肜w維素和木質(zhì)素結(jié)構(gòu)是白腐真菌的主要降解部位[25-26],密孔菌在以玉米秸稈為主料的培養(yǎng)基上產(chǎn)漆酶酶活高于以小麥秸稈和楊樹木屑為主料的培養(yǎng)基,可達(dá)40.92 U·mg-1．這是因?yàn)橛衩捉斩?、小麥秸稈以及楊樹木屑三者的組成成分、含量以及物理結(jié)構(gòu)不同,玉米、小麥秸稈和楊樹木屑中木質(zhì)素的含量分別為14.93%，20.51%和35%[27-28]．隨著發(fā)酵周期的延長(zhǎng),漆酶活性逐漸下降,主要是因?yàn)榫z生長(zhǎng)活力下降和秸稈中的木質(zhì)素只能部分被降解的緣故[29]．

Cu2+的存在或濃度變化顯著影響密孔菌產(chǎn)漆酶的酶活．多數(shù)漆酶是含銅的蛋白,而漆酶基因轉(zhuǎn)錄合成時(shí)需要銅離子的調(diào)節(jié),因此在限銅或缺銅時(shí),漆酶蛋白表達(dá)受限,所以活力較低[30]．發(fā)酵料中的Cu2+濃度對(duì)密孔菌的漆酶活性的影響,隨著秸稈種類的不同而存在差異,具體的調(diào)節(jié)機(jī)理則需進(jìn)一步的研究．

pH值對(duì)密孔菌產(chǎn)漆酶有明顯影響,在中酸性環(huán)境中菌株產(chǎn)漆酶酶活較高．一般認(rèn)為培養(yǎng)基中的氫離子和氫氧根離子對(duì)微生物的影響是間接的,首先作用于胞外可解離的弱酸或弱堿,形成易透過(guò)細(xì)胞膜的游離態(tài)進(jìn)入胞內(nèi),再作用于參與代謝的各種酶類,從而影響菌體的生長(zhǎng)和酶的合成[31]．

菌株在小麥秸稈和玉米秸稈培養(yǎng)基上發(fā)酵產(chǎn)酶的最適溫度較高,分別為35℃和40℃,且在整個(gè)發(fā)酵周期能維持較高較穩(wěn)定的酶活水平．運(yùn)用本實(shí)驗(yàn)菌株進(jìn)行這兩類農(nóng)業(yè)廢棄物降解時(shí),在保持較高濕度的同時(shí),應(yīng)適當(dāng)增加堆料厚度,提高料內(nèi)溫度．

對(duì)于不同的農(nóng)業(yè)廢棄物,菌株產(chǎn)酶的最適銅離子濃度、最適pH和最適培養(yǎng)溫度也是不同的,因此我們要因材制宜．密孔菌能利用農(nóng)業(yè)廢棄物發(fā)酵產(chǎn)漆酶,可以作為外源菌劑縮短秸稈還田周期,在農(nóng)業(yè)廢棄物資源利用方面具有廣闊的應(yīng)用前景．此外,產(chǎn)生的漆酶具有降解DDT等多種污染物的能力,還可以起到環(huán)境保護(hù)和生態(tài)修復(fù)的作用．

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[責(zé)任編輯：蔣海龍]

Research on Laccase Production by Pycnoporus in Solid-Stage Fermentation using Agricultural Residues

LI Xiu-nan1, NIU Zi-qi1, HU Wei-cheng1,2,3, WANG Xin-feng1,2,4

(1.College of Life Sciences, Huaiyin Normal University, Huaian Jiangsu 223300, China) (2.Huaian Key Laboratory of Food Components and Functional Foods, Huaian Jiangsu 223300, China) (3.Jiangsu Collaborative Innovation Center of Regional Modern Agriculture & Environmental protection, Huaian Jiangsu 223300, China) (4.Jiangsu Key Laboratory for Biomass-based Energy and Enzyme Technology, Huaian Jiangsu 223300, China)

The aim of this study is to investigate laccase production by Pycnoporus in solid-stage fermentation using different agricultural residues, such as corn stalk, wheat straw and poplar sawdust. The results reveled that agricultural residues can induce Pycnoporus to produce laccase and corn stalk showed the highest effect with production of 40.92 Umg-1. Moreover, the concentration of Cu2+has a significant effect on laccase production and the production could reach 41.24Umg protein-1 and 57.13Umg-1using wheat straw and poplar sawdust as medium with 0.02% Cu2+; the production of laccase could reach 94.92 U·mg-1using corn stalk as medium with 0.04% Cu2+. Lassase production was affected by pH obviously and the activity of laccase was higher in neutral and acid environment. The optimum temperature for Pycnoporus to produce laccase in wheat straw medium and corn stalk medium was 35°C and 40°C, respectively. Moreover, laccase activity could maintain a high and stable level during the whole fermentation period. The results from this study indicate that Pycnoporus has a high efficacy in producing laccase and degrading crop straw, which can be used in the treatment of crop straw.

pycnoporus; solid state fermentation; agricultural wastes; laccase

2017-03-28

江蘇省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201510323013Z); 江蘇高校品牌專業(yè)建設(shè)工程資助項(xiàng)目(PPZY2015A018); 江蘇省農(nóng)業(yè)自主創(chuàng)新基金項(xiàng)目(CX(13)3026)

王新風(fēng)(1964-),男，江蘇漣水人，教授，主要從事微生物及食用菌等研究. E-mail: wangxf@hytc.edu.cn

S147.4

A

1671-6876(2017)02-0147-07