彭 峰，彭奕華，張宏華

（韶關(guān)市粵北人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，廣東 韶關(guān) 512026）

近年來，肺癌的發(fā)病率逐年上升，嚴(yán)重地威脅到了人們的健康生活，作為一種常見的惡性腫瘤，其中的病因還沒有完全明確，其中的發(fā)展變化涉及的是一個多階段的復(fù)雜過程[1]。在肺癌發(fā)生的過程中，只要涉及的環(huán)節(jié)有抑癌基因的活性降低、癌基因的表達(dá)變得活躍、DNA的修復(fù)基因缺失，任何一個環(huán)節(jié)都有可能造成肺癌的發(fā)生，研究發(fā)現(xiàn)[2]：發(fā)生腫瘤的主要的原因是基因啟動子區(qū)域的甲基化過程發(fā)生了異常的變化，甲基化修飾出現(xiàn)異常的情況時，基因的表達(dá)、細(xì)胞的分化及繁殖都會出現(xiàn)異常，嚴(yán)重的威脅到了人們的正常生活。

本文主要研究了甲基化抑制劑5-氮雜-2'脫氧胞苷 (5-Aza-CdR)對肺癌A549細(xì)胞株DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNMT1)及c-myc、MKi-67、p53基因表達(dá)的影響，其中采用的是分組對比的研究方式，通過研究發(fā)現(xiàn)采用甲基化抑制劑5-Aza-CdR可以降低肺癌A549細(xì)胞中的DNMT1及c-myc、MKi-67、p53基因表達(dá)量，升高p53基因的表達(dá)量，其中具體的數(shù)據(jù)分析如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

在進(jìn)行研究的過程中選取肺癌A549細(xì)胞株作為主要的研究對象，所用到的材料有甲基化抑制劑5-Aza-CdR，采用的培養(yǎng)基為1640，采用的引物主要有：

DNMT1：上游5’ ATCTAGCTGCCAAACGGAGG-3’

下游5’ CTGAATGCACTTGGGGAGGGT-3’，191 bp；c-myc：上游5’ TACAACACCCGAGCAAGGAC-3’

下游5’ TTCTCCTCCTCGT-CGCAGTA-3’，259 bp;MKi-67：上游5’ ACACTCCACCTGTCCTGAAG-3’

下游5’ AG-GCAGGTTGCCACTC-TTTC-3’，251 bp;p53：上游5’ TCTTGTTCCCCACTGACAGC-3’

下游 5’ GTGCAG-GCCAACTTGTTCAG-3’，159 bp;β-action：上游5’ TGGCACCCAGCACAATGAA-3’

下游5’CTAAGT-CATAGTCCGCCTAGAAGCA-3’，186bp;SYBR Premix Ex TaqTMⅡ，DNMT1 及 c-myc、MKi-67、p53 單克隆抗體及二抗。

1.2 方法

1.2.1 A549細(xì)胞株的培養(yǎng)及傳代：在對A549細(xì)胞株進(jìn)行培養(yǎng)的過程中，選取的培養(yǎng)液為濃度是10%的胎牛的血清1640培養(yǎng)溶液，放入適宜的環(huán)境中對肺癌A549細(xì)胞株進(jìn)行培養(yǎng)。在培養(yǎng)的細(xì)胞群中選擇細(xì)胞的匯合率達(dá)到了75%左右的細(xì)胞，對與貼壁緊密并且牢固的細(xì)胞優(yōu)先選擇，保證細(xì)胞處于一個良好的生長狀態(tài)，這樣可極大的保證傳代細(xì)胞的質(zhì)量，傳代的過程中，結(jié)合實際的情況選擇的時間為3d左右，將最終操作完成的傳代細(xì)胞進(jìn)行收集，一部分為觀察組使用，另一部分為對照組，在觀察組中加入5-Aza-CdR，其中的濃度為5μmol/L，對照組不加入任何藥物。

1.2.2 采用FQ-PCR對mRNA的表達(dá)進(jìn)行檢測：將合成的cDNA作為模板，并且按照SYBR Premix Ex TaqTMⅡ說明書上的內(nèi)容進(jìn)行操作，其中引物上游為0.8 μL，下游為ROX Reference Dye（50×）0.40 μL，其中 cDNA 模板 2 μL，ddH2O 6 μL，擴(kuò)增參數(shù)為 95℃ 30 min；95℃ 5 s；60℃ 30 s，在循環(huán)結(jié)束之后進(jìn)行熒光采集檢測。

1.2.3 檢測蛋白表達(dá)：對蛋白的濃度進(jìn)行檢測，主要采用的是蛋白裂解液，并且進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜，需要的時間大約為1h左右，封閉放入溫室后進(jìn)行孵育工作，并進(jìn)行顯色及曝光的處理。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

各個實驗進(jìn)行獨立重復(fù)的三次操作，統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS16.0分析數(shù)據(jù)，計量資料利用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較行t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 A549細(xì)胞株的培養(yǎng)及傳代

對兩組的細(xì)胞進(jìn)行藥物處理3d之后，觀察兩組細(xì)胞的生長情況，研究發(fā)現(xiàn)觀察組的細(xì)胞生長受到明顯的抑制，具體的數(shù)據(jù)分析如表1。

表1 兩組DNMT1及c-myc、MKi-67、p53表達(dá)量對比（±s）

表1 兩組DNMT1及c-myc、MKi-67、p53表達(dá)量對比（±s）

項目mRNA組別觀察組對照組tP--DNMT1 0.32±0.01 1.03±0.05 82.377 c-myc 0.32±0.02 1.01±0.02 144.324 p53 1.56±0.03 0.85±0.07 22.528＜0.05 MKi-67 0.25±0.01 0.97±0.02 190.494

2.2 兩組細(xì)胞DNMT1及c-myc、MKi-67、p53蛋白表達(dá)

通過研究發(fā)現(xiàn)觀察組的DNMT1及c-myc、MKi-67的蛋白表達(dá)量明顯的低于對照組，p53蛋白表達(dá)量明顯高于對照組，具體的數(shù)據(jù)分析如表2。

表2 兩組細(xì)胞DNMT1及c-myc、MKi-67、p53蛋白表達(dá)（±s）

表2 兩組細(xì)胞DNMT1及c-myc、MKi-67、p53蛋白表達(dá)（±s）

項目蛋白組別觀察組對照組t P--DNMT1 0.42±0.02 1.20±0.05 85.689 c-myc 0.43±0.02 1.30±0.10 4.678 p53 1.90±0.05 0.71±0.01 138.068＜0.05 MKi-67 0.32±0.02 0.50±0.08 12.917

3 討論

作為一種DNA的甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，5-Aza-CdR能夠迅速的與DNA的甲基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行結(jié)合，使得酶的活性降低，通過降低甲基化的水平來對基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)整，因此在由于啟動子甲基化造成的基因表達(dá)的不充分甚至缺失的疾病中，經(jīng)常采用5-Aza-CdR來進(jìn)行治療[3]。c-myc是一種可異位基因，同時也是myc基因家族中的核心組成部分，它是一種可調(diào)節(jié)的基因，主要作用使細(xì)胞進(jìn)行不斷的生長、繁殖，并且可以促使細(xì)胞分裂，與腫瘤的發(fā)生有著密切的關(guān)系，該基因在正常的細(xì)胞轉(zhuǎn)為癌細(xì)胞的過程中起著重要的作用[4]。MKi-67作為一種核抗原與增殖細(xì)胞有著密切的關(guān)系，如細(xì)胞的有絲分裂，在繁殖的過程中必不可少，該細(xì)胞的表達(dá)范圍除了G0期以外的各個周期的細(xì)胞，成為了判斷細(xì)胞增殖活性的重要的指標(biāo)，該蛋白是唯一一個與細(xì)胞的周期及增殖活動相關(guān)的蛋白。大量的臨床試驗研究表明[5]，DNMTI在癌細(xì)胞中起著很重要的作用，DNMT1作為DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的主要的部分，可以對DNA進(jìn)行復(fù)制及修復(fù)，它不僅對DNA甲基化的關(guān)鍵酶起著催化的作用，而且還有很好的維持DNA甲基化的作用。一般發(fā)生癌變腫瘤的原因是，DNMTI的表達(dá)增強，致使患者體內(nèi)的抑癌基因CpG導(dǎo)致DNA異常甲基化，使其不能正常的表達(dá)，最終發(fā)生癌變。一般在胃癌、肺癌以及卵巢癌中DNMTI的表達(dá)最高，并且可以作為癌變基因的一個重要診斷依據(jù)[6]。P53也屬于人體中的抑癌基因，它有著轉(zhuǎn)靈激活的作用，這種基因如果失活很可能會形成腫瘤，并且它是目前臨床上公認(rèn)的抑癌基因之一，應(yīng)該引起關(guān)注[7]。

本文研究的主要內(nèi)容是甲基化抑制劑5-Aza-CdR對肺癌A549細(xì)胞株DNMT1及c-myc、MKi-67、p53基因表達(dá)的影響，采用分組對照的方式進(jìn)行研究，觀察組細(xì)胞中采用5-Aza-CdR藥物處理，對照組中不采用任何藥物處理，通過一段時間的處理之后研究發(fā)現(xiàn)，觀察組的細(xì)胞生長受到的明顯的抑制，并且觀察組中的DNMT1及c-myc、MKi-67的蛋白表達(dá)量明顯的低于對照組，p53蛋白表達(dá)量明顯高于對照組，主要的作用機(jī)制大概是5-Aza-CdR一方面是使得細(xì)胞發(fā)生了去甲基化[8]，另外一方面可能是甲基化等到了抑制，癌基因的表達(dá)不再活躍，使得抑癌基因的表達(dá)更加充分，加速了腫瘤細(xì)胞的凋亡，并且使得腫瘤細(xì)胞的繁殖率明顯的降低，腫瘤細(xì)胞的負(fù)調(diào)控機(jī)制不斷的加強，與此同時激活了抑癌基因的表達(dá)，從而有效控制腫瘤基因的表達(dá)[9]。其中研究還發(fā)現(xiàn)[10]，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1以及c-myc、MKi-67、p53都是肺癌發(fā)生的關(guān)鍵因子，任何一種因子的表達(dá)發(fā)生異常情況時，都有可能促使腫瘤的生長及繁殖，5-Aza-CdR通過控制基因啟動子區(qū)的過度甲基化，從而控制腫瘤的進(jìn)一步的惡化[11]。

綜上所述，甲基化抑制劑5-Aza-CdR明顯的降低了肺癌A549細(xì)胞中的DNMT1及c-myc、MKi-67、p53基因表達(dá)量，使得p53基因表達(dá)量升高，抑制了癌基因的表達(dá)，使得腫瘤細(xì)胞的生長得到有效的控制，為采用去甲基化的方式進(jìn)行治療肺癌提供了有力的依據(jù)[12]。

[1]張博，劉文洲，孫宇，等.甲基化抑制劑5-Aza-CdR對肺癌A549細(xì)胞株DNMT1及c-myc、MKi-67、p53基因表達(dá)的影響[J].廣東醫(yī)學(xué)，2016,2（11）:194-196.

[2]趙瑩，孫麗華，楊振華，等.5-Aza-CdR對肺癌A549細(xì)胞DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性的影響[J].南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2009,6（13）:767-778.

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