□ 舒 靜 陜西省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院 孫麗君 陜西省人民醫(yī)院中心實驗室樊 成 嚴 燁 王 瑛 鄭玉紅 陜西省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院

實時熒光PCR檢測肉制品中羊源性成分

□ 舒 靜 陜西省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院 孫麗君 陜西省人民醫(yī)院中心實驗室
樊 成 嚴 燁 王 瑛 鄭玉紅 陜西省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院

為了建立一種快速檢測肉制品中羊源性成分的方法，本文根據(jù)羊特異性線粒體DNA片段，設(shè)計合成引物，通過檢測引物的特異性及方法靈敏性，建立肉制品中羊源性成分實時熒光PCR檢測方法。

羊源性成分；肉制品；實時熒光PCR方法

據(jù)報道，某些不法企業(yè)和個人利用雞肉或鴨肉等廉價肉冒充牛肉、羊肉，在熟食加工時會加入香料、調(diào)味品等食品添加劑以掩蓋這種造假行為，由于肉制品加工后不能用肉眼判斷其種屬，使假冒產(chǎn)品更容易被市場銷售，極大的侵犯了市場消費者的合法權(quán)益[1]。食品安全是關(guān)乎大家的重大民生問題，食品摻假問題不僅涉及經(jīng)濟、營養(yǎng)價值和食品安全等方面，牛羊肉的摻假而且涉及群眾宗教信仰。所以，鑒定肉制品物種源性是食品安全檢測中的必要檢測。

目前，針對肉類制品中的物種鑒別主要方法有高效液相色譜（HPLC）[2]、等電聚焦電泳（IEF）[3]、酶聯(lián)免疫測定（ELISA）[4]等方法，但都因存在周期長、靈敏度低、不能檢測熟肉加工品等缺點而未被廣泛使用[5]。實時熒光PCR相比于一般PCR，檢測時間短，無需瓊脂糖凝膠電泳，避免產(chǎn)物污染和EB對實驗人員的危害，具有快速簡便的特點。而且無論是生熟肉還是其加工品，均可進行檢測，實時熒光PCR技術(shù)已經(jīng)逐步取代了一般的PCR方法[6]，已逐步成為肉類成分鑒別的主流技術(shù)[7]。本文根據(jù)羊線粒體特異基因序列設(shè)計特異性的引物，用實時熒光PCR方法檢測對肉制品中羊源性成分，為食品市場快速檢測肉制品中的羊源性成分構(gòu)建技術(shù)平臺。

1 材料與方法

1

.1 材料

1.1.1 標本

本試驗的標本羊肉干、羊肉卷、生羊肉、熟羊肉等肉制加工品，均來源于當?shù)啬吵小?/p>

1.1.2 主要試劑

Tissue DNA Kit（OMEGA）和熒光PCR酶SYBRⅡ（TAKARA）。

1.1.3 主要儀器

熒光PCR儀ABI7500（life）、漩渦振蕩器（大龍興創(chuàng)）、NANODROP 2 000C（Thermo scientific公司）和離心機（大龍興創(chuàng)）。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank中查詢的羊源性特異性DNA序列，內(nèi)參引物為動物共同的一段保守序列，設(shè)計合成一對對特異性引物及一對內(nèi)參引物，由華大公司合成，其序列見表1。

1.2.2 模板DNA的提取

模板DNA抽提按照OMEGA組織DNA提取試劑盒中的說明書進行抽提。

1.2.3 模板DNA含量的測定

取1 μL模板DNA，利用紫外分光光度計檢測模板DNA，A260/A280比值檢測在1.8～2.0，則證明抽提的核酸DNA模板質(zhì)量合格。

1.2.4 多重實時熒光PCR擴增體系及條件

羊源性成分檢測體系包含SYBRⅡ10 μL、模板1 μL、羊上、下游引物各0.5 μL、ddH2O 8 μL；內(nèi)參檢測PCR體系包含SYBRⅡ 10 μL、模板1 μL、內(nèi)參上、下游引物各0.5 μL、ddH2O 8 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，35個cycels，PCR溶解曲線條件為60 ℃ 15 s，90 ℃ 15 s。

1.2.5 引物特異性試驗

選取抽提得到的豬、牛、羊、雞、鴨、鵝、驢和馬的DNA，分別用羊引物進行多重實時熒光PCR方法檢測，判定羊引物的特異性。

1.2.6 方法靈敏度試驗

將抽提的羊肉DNA進行濃度稀釋至每個模板羊肉的含量依次為20%、10%、5%、2%和1%（V︰V）5個稀釋度的模板DNA進行羊源性成分的檢測，驗證方法的靈敏度。

1.2.7 羊源性多重實時熒光PCR方法的應(yīng)用

利用本文方法檢測市場上的羊肉加工樣品，檢測結(jié)果說明，部分與標注不符。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)果判讀

陽性結(jié)果判定：在陰性對照無熒光信號和模板內(nèi)參基因Ct值小于25的條件下，羊源性檢測體系中有熒光信號并且Ct值小于30，證明樣本有羊源性成分，Ct大于30證明無羊源性成分。

2.2 特異性試驗

利用羊源性引物對豬、牛、羊、雞、鴨、鵝、驢和馬的8種肉制品樣本進行檢測，結(jié)果見表2。檢測結(jié)果顯示，只有羊肉制品樣本的結(jié)果為陽性，其余物種的肉制品樣本均為陰性，由此可證明此方法引物特異性比較好。

2.3 靈敏度試驗

用紫外分光光度計檢測羊肉DNA濃度，以初始約50 ng/μL進行稀釋，每個模板中羊肉的含量依次為20%、10%、5%、2%和1%，靈敏度試驗重復(fù)三次。羊源性成分擴增曲線圖，如圖1所示。PCR檢測結(jié)果說明，羊肉含量為1%時仍可檢測出。

表1 引物序列表

表2 特異性檢測表

圖1 羊源性成分擴增曲線圖（從左到右依次為20%、10%、5%、2%和1%）

表3 多重實時熒光PCR檢測羊源性成分應(yīng)用表

2.4 多重實時熒光PCR檢測羊源性成分應(yīng)用

利用建立的羊源性成分PCR檢測方法，檢測市售的某些羊肉產(chǎn)品。檢測結(jié)果中，某些產(chǎn)品與標述不符合，檢測結(jié)果見表3。

3 結(jié)論

本試驗通過內(nèi)參基因的檢測可以避免由于模板原因而造成的結(jié)果誤判，減少了假陰性的原因，如果試驗結(jié)果擴增曲線不明顯或者CT值在30，即可重復(fù)實驗檢測。目前，基于PCR和實時熒光PCR方法檢測飼料和肉制品中的動物源性成分已經(jīng)得到了較多的關(guān)注和研究[8-12,5]，此方法彌補了普通PCR電泳污染及費時的問題，為食品監(jiān)管部門加強食品安全管理、打擊肉制品市場上的以廉價肉冒充羊肉的現(xiàn)象提供了強有力的技術(shù)支持[13]。通過對市售羊肉制品的檢測證明，此方法與行標方法檢測結(jié)果一致，檢測結(jié)果說明在羊肉卷和羊肉干中摻假的現(xiàn)象比較多，同時該方法也為肉制品中各動物源性成分含量的檢測奠定了基礎(chǔ)，保證消費者的健康及保護其合法權(quán)益。綜合分析此方法快速簡便經(jīng)濟，基本可以滿足市場對羊肉制品檢測的要求。

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陜西省科技計劃項目（編號：2016KTCQ03-04）。

舒靜（1981-），女，陜西西安人，本科，工程師，主任。研究方向：食品與微生物檢驗。

舒靜。