□ 郭麗儀 黃永連 梁詠瑜 賴文婷 廣東省質(zhì)量監(jiān)督食品檢驗(yàn)站；廣東省食品工業(yè)研究所；廣東省食品工業(yè)公共實(shí)驗(yàn)室

高效液相色譜法測定維生素軟糖中葉酸的含量

□ 郭麗儀 黃永連 梁詠瑜 賴文婷 廣東省質(zhì)量監(jiān)督食品檢驗(yàn)站；廣東省食品工業(yè)研究所；廣東省食品工業(yè)公共實(shí)驗(yàn)室

本文建立了高效液相色譜法測定維生素軟糖中葉酸含量的方法。結(jié)果可得出，該方法快速、可靠，可適用于維生素軟糖中葉酸的含量測定。

葉酸；高效液相色譜；維生素

葉酸，是一種重要的B族維生素，天然存在于部分食物當(dāng)中，也作為添加劑被適量加入到一些營養(yǎng)強(qiáng)化食品、保健食品中，準(zhǔn)確測定葉酸含量對產(chǎn)品的生產(chǎn)加工、功效評價(jià)等有重要意義[1]。目前，市場上銷售的營養(yǎng)素補(bǔ)充劑幾乎都添加有葉酸［2］。有關(guān)葉酸分析的方法有熒光法[3]、電化學(xué)法[4]、微生物法［5］以及高效液相色譜法[6-7]。其中，以高效液相色譜法最為常用。葉酸在不同食物中的存在形式不一樣，用一般的檢測方法并不能進(jìn)行提取分離和測定，而采用高效液相色譜法就可以把以不同形式存在的葉酸分開并進(jìn)行定量分析。本實(shí)驗(yàn)中建立了用反相液相色譜測定維生素軟糖食品中葉酸含量的方法和條件。在樣品前處理和流動相進(jìn)行了優(yōu)化，試劑易得，價(jià)格便宜，方法操作更簡單、快速，而且分離效果好，能滿足維生素軟糖中葉酸含量的檢測。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 試劑

葉酸標(biāo)準(zhǔn)品（中國藥品生物制品檢定所）、甲醇（色譜純）、碳酸鈉（Na2CO3）、乙酸、乙酸銨、庚烷磺酸鈉、三乙胺、冰乙酸、磷酸和純水（除特殊注明外，本實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純）。

1.1.2 儀器

Agilent l200高效液相色譜系統(tǒng)、紫外檢測器、Agilent SB-AQ C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱和昆山牌超聲波清洗儀KQ-500DE型。

1.2 色譜條件

Agilent SB-AQ C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；色譜柱溫度：30 ℃；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：50.0 μL；檢測波長：275 nm。所用試劑和溶液進(jìn)入色譜系統(tǒng)之前經(jīng)0.45 μm微孔濾膜壓濾。

1.3 分析步驟

1.3.1 緩沖溶液的制備

稱取90.0 g乙酸銨置于500 mL燒杯中，分別加入120 mL純水和30 mL乙酸溶解并混勻。

1.3.2 提取液（0.1 mol/L Na2CO3）的制備

稱取10.599 g Na2CO3置于1 L容量瓶中，用純水溶解并稀釋至刻度，搖勻。

1.3.3 流動相D瓶

稱取2.0 g庚烷磺酸鈉，分別加入3.0 mL三乙胺和冰乙酸20 mL，用純水定容至2 L，并用磷酸調(diào)節(jié)pH至2.5。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)儲備液的制備

精密稱取葉酸標(biāo)準(zhǔn)品0.010 0 g置于100 mL棕色容量瓶中，用0.1 mol/L Na2CO3溶解并稀釋至刻度，搖勻，0.45 μm有機(jī)濾膜壓濾，濾液作為標(biāo)準(zhǔn)品溶液，此溶液濃度為100 μg/mL。

1.3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別取100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液0.5、1.00、2.50、5.00 mL和10.00 mL，置于50 mL棕色容量瓶中，各加入2 mL緩沖溶液，用0.1 mol/L Na2CO3稀釋至刻度，此時(shí)標(biāo)準(zhǔn)使用液濃度分別為1.00、2.00、5.00、10.00 μg/mL和20.00 μg/mL。分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖和峰面積，以葉酸濃度（x，μg/mL），對相應(yīng)峰面積（y）進(jìn)行線性回歸，回歸方程為：y=156.630 60x-5.184 10，r=1.000 00（n=5），結(jié)果葉酸濃度在1.000～20.00 μg/mL，線性關(guān)系良好，如圖1所示。

1.3.6 供試品溶液的配制

精密稱取樣品2.012 3 g置于50 mL棕色容量瓶中，加入適量（約30mL）0.1 mol/L Na2CO3搖勻，超聲30 min，加入2 mL緩沖液混勻，用0.1 mol/ L Na2CO3定容至刻度，充分搖勻，再經(jīng)0.45 μm有機(jī)濾膜壓濾，續(xù)濾液作為供試品溶液。樣品色譜圖，如圖2所示。（注意事項(xiàng)：樣品加入緩沖液之后，大多數(shù)會產(chǎn)生大量氣泡。因此，在加入緩沖液之前，加入0.1 mol/L Na2CO3時(shí)不能加太多，而且加緩沖溶液一定要在超聲之后，要控制好pH值，使提取完全；若有黑色樣品，不可隨意上機(jī)，會影響柱效。）

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理?xiàng)l件的選擇

葉酸在堿性條件下易溶且穩(wěn)定性好，受熱和見光也不會分解[8]，而其他水溶性維生素則在酸性條件下穩(wěn)定，所以溶解樣品時(shí)用0.1 mol/L Na2CO3溶液（選擇Na2CO3的原因，比較穩(wěn)定且存放時(shí)間長，避免了氨水的刺激性氣味和易揮發(fā)的缺點(diǎn)），可以避免其他水溶性維生素的干擾。在實(shí)驗(yàn)中，分別比較常溫30 ℃、40 ℃的提取效果。結(jié)果表明，30 ℃，提取30 min的條件可以得到滿意的效果。

2.2 流動相的選擇

2.2.1 流動相緩沖液pH的選擇

在實(shí)驗(yàn)中，將流動相D的pH值分別調(diào)到2.0、2.5、3.0。結(jié)果表明，當(dāng)pH為2.5時(shí)，在分離時(shí)間、分離效果上都比較好。峰形好，不拖尾。綜合考慮保留時(shí)間和分離效率，所以選擇流動相緩沖溶液為pH2.5。

2.2.2 流動相比例的選擇

對于流動相D和甲醇的比例進(jìn)行了反復(fù)實(shí)驗(yàn)，考察了流動相組成對保留時(shí)間的影響。隨著甲醇比例的增大，保留時(shí)間縮短，柱效提高。同時(shí)，又因?yàn)榧状急壤?，容量因子降低。梯度變化大則使柱效提高，但峰形的對稱因子降低；梯度變化小則使保留時(shí)間延長，柱效降低。因此，考慮采用梯度洗脫的方法進(jìn)行分離。梯度洗脫程序見表1。

2.3 檢測波長的選擇

取適量的標(biāo)準(zhǔn)液于紫外U-2 000中掃描，在275 nm處測得最大吸收，故實(shí)驗(yàn)采用275 nm作為檢測波長。

2.4 含量的測定

使用外標(biāo)法定量。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取上述標(biāo)準(zhǔn)儲備液上機(jī)，以標(biāo)準(zhǔn)儲備液的峰面積（A）為橫坐標(biāo)，濃度（C）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

結(jié)果計(jì)算：

式中：y為維生素軟糖葉酸的含量，mg/100 g；C樣為標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出來的樣品中葉酸的實(shí)際濃度；v為樣品的定容體積，mL；f-1為樣品的稀釋倍數(shù)；m為樣品的質(zhì)量，g。

2.5 供試品溶液穩(wěn)定性

取“1.3.6”項(xiàng)供試品溶液室溫放置分別于0、3、6、9、12 h和24 h，進(jìn)樣50.0 μL，測定峰面積和記錄色譜圖，其結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.72%（n=6）。表明供試品溶液在24 h內(nèi)的穩(wěn)定性良好（結(jié)果見表2）。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

圖2 樣品色譜圖

表1 梯度洗脫程序表

2.6 精密度試驗(yàn)

取“1.3.6”項(xiàng)供試品溶重復(fù)進(jìn)樣6次，以峰面積A計(jì)算樣品的相對偏差（RSD）%，結(jié)果見表3。表3結(jié)果顯示：維生素軟糖葉酸RSD為1.63%，RSD＜3%，重復(fù)性良好。

3 結(jié)語

本實(shí)驗(yàn)通過控制緩沖液pH，梯度洗脫測定維生素軟糖中的葉酸含量，在1.00～20.00 μg/mL濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（r＝1.000 00）。該方法前處理簡單，試劑易得，分析時(shí)間較短，靈敏度高，可用于維生素軟糖中葉酸的含量測定。

[1]羅建波.保健食品中葉酸的高效液相色譜測定法[J].職業(yè)與健康,2003(9):36-37.

[2]鄧富良,陳本美,饒均明,等.高效液相色譜法測定血漿中左亞葉酸鈣的含量[J].分析化學(xué)(醫(yī)學(xué)期刊),2005(7):8-9.

[3]劉保生,王云科,張彥青,等.鋱－環(huán)丙沙星稀土敏化熒光猝滅法測定葉酸[J].分析化學(xué)研究簡報(bào),2007(7):1067-1070.

[4]肖路延,王萌,朱明煒,等.電化學(xué)發(fā)光法測定血清葉酸[J].中國臨床營養(yǎng)雜志,2007(2):75-78.

[5]馬景宏,張旭,王為黎,等.微生物分析法測定保健食品葉酸[J].中國微生態(tài)學(xué)雜志,2007(6):576-577.

[6]李碧琳,宋曉東.用反相離子對色譜分離和檢測水溶性維生素十二烷基磺酸鈉作離子對試劑[J].分析化學(xué),1991(8):886.

[7]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（二部.2000年版）[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2000.

[8]王存芳.高效液相法測定注射用亞葉酸鈣中的有關(guān)物質(zhì)[J].中華中西醫(yī)雜志,2004(19):11-12.

表2 穩(wěn)定性試驗(yàn)數(shù)據(jù)表

表3 精密度試驗(yàn)數(shù)據(jù)表

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（編號：2015B070701030）。

郭麗儀（1987-），女，廣東廣州人，專科，助理工程師。研究方向：食品檢驗(yàn)。