張方捷 高國(guó)棟 葉靜 黃永剛 吳浩 王平

·論著·

脂肪干細(xì)胞覆膜聚丙烯補(bǔ)片減輕疝修補(bǔ)術(shù)后炎癥反應(yīng)的研究

張方捷 高國(guó)棟 葉靜 黃永剛 吳浩 王平

目的探討脂肪干細(xì)胞（ADSCs）覆膜聚丙烯補(bǔ)片對(duì)大鼠疝修補(bǔ)術(shù)后炎癥反應(yīng)的影響。方法培養(yǎng)擴(kuò)增檢測(cè)脂肪干細(xì)胞并接種到聚丙烯補(bǔ)片上，體外培養(yǎng)10天。成年SD大鼠12只，分為覆膜組6只，未覆膜組6只，分別將ADSCs覆膜聚丙烯補(bǔ)片和聚丙烯補(bǔ)片植入覆膜組和未覆膜組大鼠的腹壁肌肉表面，檢測(cè)大鼠術(shù)前及術(shù)后3、7、14、21、28天血常規(guī)、腫瘤壞死因子-琢（TNF-琢）、白細(xì)胞介素-1茁（IL-1茁）水平。結(jié)果ADSCs在聚丙烯補(bǔ)片上附著生長(zhǎng)良好，免疫熒光檢測(cè)顯示干細(xì)胞特異性標(biāo)記CD90表達(dá)逸97%。覆膜組在術(shù)后14天炎癥反應(yīng)高峰時(shí)期白細(xì)胞計(jì)數(shù)［（10.86±0.56）伊109/L比（11.92±0.56）伊109/L，P<0.05］、TNF-琢［（87.12±12.59）滋g/L比（175.28±34.37）滋g/L，P< 0.01］、IL-1茁［（275.69±54.28）滋g/L比（501.36±98.15）滋g/L，P<0.01］均低于未覆膜組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論與聚丙烯補(bǔ)片組比較，ADSCs覆膜聚丙烯補(bǔ)片可減輕大鼠疝修補(bǔ)術(shù)后全身炎癥反應(yīng)。

大鼠；疝修補(bǔ)術(shù)；炎癥反應(yīng)；脂肪源干細(xì)胞；聚丙烯；補(bǔ)片

用人工合成補(bǔ)片進(jìn)行疝修補(bǔ)手術(shù)是治療各種腹部疝疾病廣泛使用的方法，使術(shù)后疝復(fù)發(fā)率大大降低。而人工合成補(bǔ)片，尤其是應(yīng)用最廣泛的聚丙烯補(bǔ)片在使用中仍存在諸如慢性疼痛、局部異物感、腹壁順應(yīng)性下降等問(wèn)題，對(duì)外科醫(yī)師和患者造成困擾。產(chǎn)生這些問(wèn)題的一個(gè)重要原因是人工合成材料補(bǔ)片使用后宿主組織的（亞）急性炎癥反應(yīng)導(dǎo)致局部纖維組織明顯增生，造成神經(jīng)血管壓迫，產(chǎn)生異物感，引起慢性疼痛，并使腹壁順應(yīng)性下降。我們?cè)O(shè)想使用脂肪干細(xì)胞（adipose-derived sterm cells，ADSCs）覆蓋聚丙烯補(bǔ)片，避免補(bǔ)片與機(jī)體的直接接觸，使植入體內(nèi)的ADSCs在局部微環(huán)境作用下向機(jī)體需要的方向分化，以減輕補(bǔ)片植入體內(nèi)后的炎癥反應(yīng)和組織纖維化，從而減輕異物感、慢性疼痛，提高腹壁順應(yīng)性，改善患者術(shù)后的生活質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 材料F1代SD脂肪源干細(xì)胞（CELLBIO貨號(hào)CBR-130478）購(gòu)自上海賽齊生物。SPF級(jí)SD大鼠，購(gòu)自浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，6月齡，雄性，體質(zhì)量，230～250g，合格證書(shū)編號(hào)0017686，許可證號(hào)SCYK（浙）2014-0001。聚丙烯補(bǔ)片購(gòu)自BARD公司。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中動(dòng)物處置符合國(guó)家科學(xué)技術(shù)委員會(huì)發(fā)布的關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)規(guī)定。

1.2 方法

1.2.1 脂肪干細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定脂肪干細(xì)胞解凍后置于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中，接種于25mL培養(yǎng)瓶中，置于37益、0.05%的C02孵箱中，每3天換液1次。待細(xì)胞形態(tài)已恢復(fù)并貼滿(mǎn)瓶壁，即行傳代。將培養(yǎng)瓶里的培養(yǎng)基倒去，加3～5mL Hanks'液洗滌后棄去。加0.5～1mL 0.25%含EDTA的胰酶消化，消化時(shí)間1～3min。輕輕晃動(dòng)瓶壁，細(xì)胞脫落下來(lái)后加入3～5mL培養(yǎng)基終止消化。用移液管輕輕吹打瓶壁上的細(xì)胞，使之完全脫落，然后將溶液吸入離心管內(nèi)離心1000rpm/5min。棄上清，1:2傳代。

脂肪干細(xì)胞主要從三個(gè)方面進(jìn)行鑒定評(píng)估：細(xì)胞的形態(tài)：顯微鏡觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)；細(xì)胞表面CD90的抗原表達(dá)：采用細(xì)胞免疫熒光染色法，細(xì)胞爬片6 h，4%多聚甲醛固定30min，3%Triton IOOX通透20 min，山羊血清封閉30min，按說(shuō)明書(shū)加入相應(yīng)比例稀釋的一抗，孵育4益過(guò)夜，加入熒光二抗（Alexa Fluor 555）37益孵育1h，DAPI核染10min，熒光顯微鏡下觀(guān)察。臺(tái)盼藍(lán)染色法鑒定細(xì)胞活力：取細(xì)胞懸液，滴加等量0.4%臺(tái)盼藍(lán)染液，混勻后吸取部分加入細(xì)胞計(jì)數(shù)板中進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.2 脂肪干細(xì)胞覆膜聚丙烯補(bǔ)片制備將聚丙烯補(bǔ)片剪成5mm伊5mm大小，浸泡75%乙醇中24h，以D-hank's液反復(fù)清洗去除乙醇。將培養(yǎng)至第2代的脂肪干細(xì)胞消化、重懸后計(jì)數(shù)為5伊108/L。每塊補(bǔ)片接種100滋L細(xì)胞懸液，分別放置于6孔培養(yǎng)板中。4h后加入DMEM-F12培養(yǎng)液8mL，于37益、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天更換培養(yǎng)液1次，共培養(yǎng)10天。

1.2.3 動(dòng)物分組、手術(shù)及血樣采集成年雄性SD大鼠12只，體質(zhì)量（250±20）g，隨機(jī)分為覆膜補(bǔ)片組（覆膜組）和未覆膜補(bǔ)片組（未覆膜組），每組6只。手術(shù)前一天尾靜脈抽取血樣檢查血常規(guī)、腫瘤壞死因子-琢（TNF-琢）、白細(xì)胞介素-1茁（IL-1茁）。10%水合氯醛0.3mL/100g麻醉，5萬(wàn)U/只青霉素鈉肌肉注射預(yù)防感染，切開(kāi)大鼠腹側(cè)壁約1cm，分別將覆膜補(bǔ)片及未覆膜補(bǔ)片植入腹壁肌層下方，補(bǔ)片縫合固定，可吸收線(xiàn)縫合切口。術(shù)后3、7、14、21、28天抽血檢驗(yàn)血常規(guī)、TNF-琢、IL-1茁。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定ADSCs接種于培養(yǎng)皿24h后細(xì)胞形態(tài)開(kāi)始恢復(fù)為梭形及多邊形，傳代后細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，并形成小集落，呈束狀、菊花狀或旋渦狀排列，生長(zhǎng)有方向性。免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，干細(xì)胞特異性標(biāo)記CD90表達(dá)逸97%。臺(tái)盼藍(lán)染色顯示細(xì)胞存活良好。

2.2 覆膜聚丙烯補(bǔ)片制備共培養(yǎng)后可見(jiàn)脂肪干細(xì)胞附著于聚丙烯補(bǔ)片上生長(zhǎng)，編織密集處生長(zhǎng)較密集。

2.3 大體觀(guān)察聚丙烯補(bǔ)片植入后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物無(wú)死亡，未出現(xiàn)侵蝕穿透等表現(xiàn)，傷口愈合均良好。

2.4 兩組大鼠手術(shù)前后白細(xì)胞數(shù)值比較覆膜組和未覆膜組術(shù)后均出現(xiàn)白細(xì)胞升高，14天時(shí)達(dá)到最高峰，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），之后數(shù)值下降。見(jiàn)表1。

2.5 兩組大鼠手術(shù)前后血清TNF-琢和IL-1茁比較術(shù)前兩組血清TNF-琢和IL-1茁差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；術(shù)后3、7、14、21天，兩組大鼠血清TNF-琢和IL-1茁水平均明顯上升，14天時(shí)達(dá)到峰值，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均<0.01）；術(shù)后28天，未覆膜組兩項(xiàng)指標(biāo)仍高于覆膜組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表2～3。

3 討論

腹股溝疝是普外科常見(jiàn)病、多發(fā)病，區(qū)域性調(diào)查顯示我國(guó)腹股溝疝的發(fā)病率為3譯～5譯[1]。腹壁切口疝是腹部手術(shù)后常見(jiàn)的并發(fā)癥，發(fā)生率3%～20%[2]。對(duì)于腹股溝疝和腹壁切口疝手術(shù)在人工合成材料補(bǔ)片出現(xiàn)以前，主要通過(guò)單純縫合修補(bǔ)來(lái)實(shí)現(xiàn)，其復(fù)發(fā)率高。目前多應(yīng)用人工合成材料補(bǔ)片進(jìn)行修補(bǔ)，從而使術(shù)后復(fù)發(fā)率大大降低[3]。但人工合成材料補(bǔ)片使用中，尤其是使用最為廣泛的聚丙烯補(bǔ)片使用中存在慢性疼痛、局部異物感明顯、腹壁順應(yīng)性下降等問(wèn)題使治療效果并不十分令人滿(mǎn)意，人工合成材料補(bǔ)片使用后宿主組織的(亞)急性炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致上述問(wèn)題的重要原因[4]。

表1 兩組大鼠手術(shù)前后白細(xì)胞數(shù)值比較（，伊109/L）

表1 兩組大鼠手術(shù)前后白細(xì)胞數(shù)值比較（，伊109/L）

注：與未覆膜組比較，*P<0.05

組別覆膜組未覆膜組鼠數(shù)（只）6 6術(shù)前7.01±1.22 7.21±1.19 3d 8.35±0.56 9.66±1.70 7d 10.59±0.36 10.87±0.79 14d 10.86±0.56* 11.92±0.56 21d 9.32±0.63 9.55±0.71 28d 8.20±0.54 8.51±0.55

表2 兩組大鼠手術(shù)前后血清TNF-琢水平比較（，滋g/L）

表2 兩組大鼠手術(shù)前后血清TNF-琢水平比較（，滋g/L）

注：與未覆膜組比較，*P<0.01

組別覆膜組未覆膜組鼠數(shù)（只）6 6術(shù)前5.23±2.56 5.17±2.87 3d 41.87±8.54 64.21±9.57 7d 50.12±7.85 90.78±75.54 14d 87.12±12.59* 175.28±34.37 21d 51.27±13.51* 91.56±20.41 28d 12.47±5.45 14.49±11.42

表3 兩組大鼠手術(shù)前后血清IL-1茁水平比較（，滋g/L）

表3 兩組大鼠手術(shù)前后血清IL-1茁水平比較（，滋g/L）

注：與未覆膜組比較，*P<0.01

組別覆膜組未覆膜組鼠數(shù)（只）6 6術(shù)前9.54±3.57 9.21±2.49 3d 78.29±15.24 159.28±54.38 7d 198.17±24.48 334.35±89.45 14d 275.69±54.28* 501.36±98.15 21d 182.35±49.82* 324.26±33.75 28d 40.73±21.25 51.46±24.25

脂肪組織位于可以較易獲得的結(jié)締組織中，與骨髓一樣來(lái)源于間充質(zhì)。Zuk等[5]于2001年首先發(fā)現(xiàn)脂肪干細(xì)胞（ADSCs）在適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)條件下能向脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、肌肉細(xì)胞及神經(jīng)組織定向分化。2009年美國(guó)斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院的研究人員發(fā)現(xiàn)抽出的人體脂肪是培養(yǎng)干細(xì)胞的最佳“溫室”。在脂肪干細(xì)胞內(nèi)，有兩種轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平高于皮膚成纖維細(xì)胞，表明在初始狀態(tài)下，脂肪干細(xì)胞更容易被誘導(dǎo)為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，并且利用脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞不需要飼養(yǎng)細(xì)胞，這無(wú)疑提高了其安全性[6]。脂肪干細(xì)胞還可以分泌血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子，促進(jìn)血管生成[7]。脂肪干細(xì)胞來(lái)源充分，可以反復(fù)取材，無(wú)免疫排斥，不涉及醫(yī)學(xué)倫理學(xué)問(wèn)題，細(xì)胞增殖快速，取材簡(jiǎn)便，分離容易，避免抽取骨髓，損傷較小，患者易于接受。Altman等[8]發(fā)現(xiàn)，植入體內(nèi)ADSCs在局部微環(huán)境作用下可以同時(shí)向成纖維細(xì)胞、鱗狀上皮細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞方向分化。另一方面，ADSCs具有旁分泌的功能，可以分泌多種膠原、纖維連接蛋白及生長(zhǎng)因子，能間接促進(jìn)組織的愈合[9]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ADSCs提取培養(yǎng)簡(jiǎn)單方便，細(xì)胞活力好，細(xì)胞CD90表達(dá)高達(dá)97%以上，ADSCs也可在聚丙烯材料補(bǔ)片上良好生長(zhǎng)。

聚丙烯等人工合成材料植入體內(nèi)后引發(fā)的炎癥反應(yīng)可以引起局部組織腫脹壞死，并導(dǎo)致明顯的纖維化，使網(wǎng)片皺縮變形，局部組織硬度增加，順應(yīng)性下降[10]，使患者出現(xiàn)疼痛、異物感，并容易出現(xiàn)復(fù)發(fā)及感染等。本研究中覆膜組和未覆膜組術(shù)前白細(xì)胞、TNF-琢和IL-1茁均無(wú)顯著性差異，在術(shù)后3、7、14、21、28天時(shí)未覆膜組三項(xiàng)指標(biāo)均高于覆膜組，其中14天時(shí)兩組白細(xì)胞數(shù)值有顯著差異，3、7、14、21天時(shí)血清TNF-琢和IL-1茁水平顯著性差異與表不符。綜合各項(xiàng)指標(biāo)，相較聚丙烯補(bǔ)片，植入ADSCs覆膜聚丙烯補(bǔ)片大鼠疝修補(bǔ)術(shù)后全身炎癥反應(yīng)可減輕，達(dá)到更好的治療效果。

［1］唐健雄.我國(guó)疝外科的進(jìn)展和存在的問(wèn)題［J］.國(guó)際外科學(xué)雜志，2010，37（1）：6-8

［2］CobbWS，KercherKW，Heniford BT.Laparoscopic repair of incisionalhernias［J］.Surg Clin N Am，2005，85（1）：91-103.

［3］Sauerland S，SchmedtCG，Lein S，etal.Primary incisional hernia repairwith orwithoutpolypropylenemesh：a reporton 384 patients with 5 year follow-up［J］.Langenbecks Arch Surg，2005，390（5）：408-412.

［4］PieridesGA，Paajanen HE，Vironen JH.Factorspredicting chronic pain after open mesh based inguinal hernia repair：A prospective cohortstudy［J］.International Journal of Surgery，2016，29：165-170.

［5］WJFM Jurgens，MJOedayrajsingh-Varma，MN Helder，et al. Effectof tissue-harvesting site on yield of stem cells derived from adipose tissue：implications for cell-based therapies［J］. Cell&Tissue Research，2008，332（3）：415-426.

［6］Sun N，Panetta NJ，Gupta DM，etal.Feeder-free derivation of induced pluripotentstem cells from adulthuman adipose stem cells［J］.Proc NatlAcadSciUSA.2009，106（37）：15720-15725.

［7］Rehman J，Traktuev D，Li J，etal.Secretion ofangiogenic and antiapoptotic factors by human adipose stromal cells［J］.Circulation，2004，109（1）：1292-1298.

［8］Altman AM，Yan YH，Matthias N，etal.IFATSSeries：Humanadipose-derivedstem cells seeded on a silk fibroin-chitosan scaffold enhancewound repair in a murine softtissue injury model［J］.Stem Cell，2009，27（1）：250-256.

［9］Kim WS，Park BS，Sung JH，etal.Wound healing effectofadi-pose-derivedstem cells：A critical role of secretory factors on human dermalfibroblasts［J］.JDermatolSci，2007，48（1）：15-24.

［10］Valentin JE，Badylak JS，Mccabe GP，etal.Extracellularmatrix bioscaffoldsfor orthopaedicapplications.Acomparativehistologic study［J］.JBone JointSurg Am，2006，88（12）：2673-2686.

（收稿：2016-10-08修回：2016-10-27）

Effect of Adipose-derived Stem Cells Coated Polypropylene Patch on the Inflammation after Herniorrhaphy

ZHANG Fangjie,GAO Guodong,YE Jing,HUANG Yonggang,WU Hao,WANG Ping.Department of Hernia& Abdominal Wall Surgery,Hangzhou First People's Hospital,Hangzhou(310000),China

Objective To investigate the effect of adipose-derived stem cells（ADSCs）coated polypropylene patch（PP）on relieving the inflammation after herniorrhaphy.M ethods The ADSCs were seeded into polypropylene mesh and in vitro cultured for 10 d.Twelve SD rats were random ly divided into control group and experimental group, with 6 rats in each group.PP coated with ADSCs and PP were implanted into the abdominal wall muscles of ex原perimental group and control group,respectively.The blood samples were collected before and 3,7,14,21 and 28d after operation to measure white blood cell（WBC）count,TNF-琢and IL-1茁.Results ADSCs grew well on the polypropylene patch,and the CD90 expression was more than 97%by immunofluorescence.In the peak period of in原flammatory reaction on Day 14,the WBC count[（10.86±0.56）伊109/L vs（11.92±0.56）伊109/L,P<0.05],TNF-琢（87.12±12.59滋g/L vs 175.28±34.37滋g/L,P<0.01）,IL-1茁（275.69±54.28滋g/L vs 501.36±98.15滋g/L,P<0.01）in experimental group were lower than those of control group.Conclusion Polypropylene patch coated with ADSCs can effecti-vely reduce the systemic inflammatory response after herniorrhephy in rats.

rats;herniorrhaphy;inflammatory response;adipose-derived stem cells;polypropylene;patch

杭州市醫(yī)療衛(wèi)生及重點(diǎn)專(zhuān)科專(zhuān)病科研攻關(guān)專(zhuān)項(xiàng)基金項(xiàng)目資助（No.20130633B03）

杭州市第一人民醫(yī)院疝和腹壁外科（杭州310000）

高國(guó)棟，E-mail：flyht66@sina.com