潘晨曦 陳健苗 呂偉旗

·藥學(xué)研究·

柳葉白前多糖、醇溶性浸出物含量測(cè)定與相關(guān)性分析

潘晨曦 陳健苗 呂偉旗

柳葉白前；多糖；浸出物；相關(guān)性分析

柳葉白前系蘿藦科植物柳葉白前Cynanchum stauntonii（Decne.）Schltr.ex.Levl.的干燥根莖，是2015版《中國(guó)藥典》收錄的兩種白前藥材之一，產(chǎn)于安徽、江蘇、浙江、湖南、江西、福建、廣東、四川、廣西和貴州等省區(qū)，性辛、苦、微溫，具有降氣，消痰，止咳的功效，用于肺氣壅實(shí)，咳嗽痰多，胸滿喘急[1-3]。柳葉白前現(xiàn)有研究主要集中在根部揮發(fā)油、甾體類等成分分離鑒定及其抗菌、抗病毒等藥理藥化作用，藥材偽品生藥學(xué)鑒定與高效優(yōu)質(zhì)栽培技術(shù)研究等方面，對(duì)不同產(chǎn)地柳葉白前種質(zhì)資源收集與評(píng)價(jià)工作鮮有報(bào)道[4-9]。藥用植物中提取的多糖具有抗腫瘤、抗病毒、提高免疫力，抗氧化等多種功效，研究表明柳葉白前根部醇提物具有鎮(zhèn)咳平喘、鎮(zhèn)痛抗炎、抗血栓形成等作用[10-14]，因此本試驗(yàn)收集全國(guó)柳葉白前主分布區(qū)18個(gè)種質(zhì)資源，以多糖與醇溶性浸出物為含量指標(biāo)，分析其與產(chǎn)地、經(jīng)緯度、海拔、農(nóng)藝性狀間的相關(guān)性，以期為柳葉白前種質(zhì)資源質(zhì)量評(píng)價(jià)與利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料2013年11月—2014年1月，收集浙江、江西、福建等省柳葉白前種質(zhì)資源18份，2014年3月將收集的種子統(tǒng)一播種，同年5月待苗高15 cm左右時(shí)統(tǒng)一移栽于我院中藥材種質(zhì)資源圃，常規(guī)大田水肥管理。原植物由陳健苗副主任藥師鑒定為蘿藦科植物柳葉白前C.Stauntonii，見表1。

1.2 儀器與試劑Milli-Q Academic超純水儀（美國(guó)Millipore公司）；UV2550紫外-可見分光光度計(jì)（上海第三分析儀器廠）；DK-S24型電熱恒溫水浴鍋（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；DGG-9070型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；DSH-9070型高溫干燥試驗(yàn)箱（杭州藍(lán)天化驗(yàn)儀器廠）；GT16-3型高速臺(tái)式離心機(jī)（北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司）；FA1004B型電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）。D（+）-無水葡萄糖（B21882）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；重蒸酚（909C024）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，濃硫酸（81007）購(gòu)自深圳市冠泰化工有限公司，其它試劑均為分析醇。

表1 供試柳葉白前種質(zhì)資源

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 農(nóng)藝性狀考察2015年10月考察農(nóng)藝性狀，每個(gè)處理隨機(jī)選取15株，用卷尺與游標(biāo)卡尺測(cè)量株高、莖粗、葉長(zhǎng)、葉寬、根狀莖長(zhǎng)、根狀莖直徑與根狀莖節(jié)間長(zhǎng)，計(jì)算葉長(zhǎng)寬比=葉長(zhǎng)/葉寬，葉長(zhǎng)寬積=葉長(zhǎng)×葉寬；采挖地下根狀莖，以10m2小區(qū)所有植株地下根狀莖干重為產(chǎn)量指標(biāo)，試驗(yàn)平行3次。

1.3.2 多糖與浸出物含量測(cè)定

1.3.2.1 樣品溶液制備與含量測(cè)定多糖含量測(cè)定采用苯酚-硫酸法，參考2015版《中國(guó)藥典》[1]：精密稱取柳葉白前粉末0.3g，加蒸餾水200mL，沸水浴回流提取3h，趁熱過濾定容至250mL，精密吸取5mL，加25mL無水乙醇，4℃放置1h，4000rpm離心1h，倒去上清，加80%乙醇20mL，4000rpm離心30min，重復(fù)1次，沉淀定容至50mL。取樣品溶液1mL，加5%苯酚溶液1mL，濃硫酸5mL，搖勻冰浴放置5min，沸水浴20min，冷卻至室溫，于488nm處測(cè)定吸光度，以蒸餾水為對(duì)照，試驗(yàn)平行3次。

醇溶性浸出物含量測(cè)定采用熱浸法，參考2015版《中國(guó)藥典》[1]：精密稱取柳葉白前粉末2.0g，加95%乙醇50mL，密塞稱重得質(zhì)量b，放置1h，80℃加熱回流提取1h，補(bǔ)差重，精密量取濾液25mL置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干后105℃干燥3h，干燥器內(nèi)冷卻稱重得質(zhì)量a，計(jì)算浸出物含量=（a－b）×

1.3.2.2 線性關(guān)系考察精密吸取0.1mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1/mL，蒸餾水補(bǔ)足2mL，按照“1.2.2.1”方法測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)Y，濃度為橫坐標(biāo)X，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，本試驗(yàn)線性方程為Y=13.856X－0.0166，R2=0.9997，濃度范圍為0.005～0.05mg/mL。

1.3.2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)取浙江松陽樣品，在“1.3.2.1”方法下制備樣品溶液，室溫避光保存，分別在0、1、2、4、8、12、24h測(cè)定OD值，計(jì)算RSD為1.21%，供試多糖樣品溶液在室溫避光保存24h穩(wěn)定。

1.3.2.4 重復(fù)性試驗(yàn)取浙江松陽樣品6份，在“1.3.2.1”方法下制備樣品溶液與測(cè)定多糖含量，得樣品平均多糖含量為8.13%，RSD為2.27%，試驗(yàn)方法重復(fù)性良好。

1.3.2.5 精密度試驗(yàn)取浙江松陽樣品溶液，按“1.3.2.1”方法下連續(xù)測(cè)定6次吸光度，得RSD為0.17%，表明儀器精密度良好。

1.3.2.6 加樣回收率試驗(yàn)取浙江松陽樣品適量，加入葡萄糖標(biāo)品，在“1.3.2.1”方法下制備樣品溶液，配制成80%、100%、120%的低、中、高3個(gè)濃度梯度分別測(cè)定多糖含量，計(jì)算加樣回收率（%）=（C-A）/B× 100%，A為樣品多糖含量，B為加入標(biāo)準(zhǔn)品含量，C為實(shí)際測(cè)得量，試驗(yàn)平行3次，得平均加樣回收率與RSD值，見表2。

1.3.2.7 數(shù)據(jù)處理應(yīng)用SPSS17.0與DPS9.05軟件處理數(shù)據(jù)，采用單因素ANOVA分析，聚類分析采用類平均法。

2 結(jié)果

2.1 不同種質(zhì)間多糖、醇溶性浸出物與農(nóng)藝性狀比較18個(gè)柳葉白前種質(zhì)間多糖、醇溶性浸出物含量、農(nóng)藝性狀均存在極顯著差異（P＜0.01）。其中，廣東陽山種質(zhì)株高、莖粗、葉寬、葉長(zhǎng)寬積，浙江臨安種質(zhì)葉長(zhǎng)，四川峨眉山種質(zhì)葉長(zhǎng)寬比，江蘇金壇種質(zhì)根狀莖長(zhǎng)、根狀莖產(chǎn)量，福建浦城種質(zhì)根狀莖直徑，浙江松陽種質(zhì)根狀莖節(jié)間長(zhǎng)指標(biāo)最高，分別達(dá)到103.66cm、2.41mm、1.18cm、7.09cm2、6.03cm、8.72、7.21cm、3.12 kg/10m2、3.21mm與3.85cm；供試柳葉白前多糖平均含量為6.54%，浙江建德種質(zhì)多糖含量最高，達(dá)8.50%，安徽祁門種質(zhì)含量最低，僅為3.84%；醇溶性浸出物平均含量為10.16%，浙江臨海種質(zhì)含量最高，達(dá)12.85%，江蘇溧陽種質(zhì)最低，僅為8.20%，見表3；相關(guān)性分析顯示，柳葉白前多糖含量與莖粗、葉長(zhǎng)、葉長(zhǎng)寬比、根狀莖直徑、根狀莖間節(jié)長(zhǎng)、產(chǎn)量指標(biāo)呈顯著正相關(guān)，與葉寬、根狀莖長(zhǎng)、海拔相關(guān)性較低；浸出物含量與葉長(zhǎng)、葉長(zhǎng)寬比、根狀莖直徑與產(chǎn)量指標(biāo)呈顯著正相關(guān)，與葉寬、根狀莖長(zhǎng)呈負(fù)相關(guān)，與經(jīng)緯度、海拔相關(guān)性較低，見表4。

2.2 主成分分析與優(yōu)良種質(zhì)篩選主成分分析顯示12個(gè)供試性狀可簡(jiǎn)化為5個(gè)主性狀成分，累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)91.21%。其中，第1主成分特征根值為5.3250，貢獻(xiàn)率為44.37%，株高、莖粗、葉長(zhǎng)、葉寬、葉長(zhǎng)寬積與產(chǎn)量指標(biāo)特征向量較大，且為正值，構(gòu)成本成分主要變異來源；第2主成分特征根值為2.7076，貢獻(xiàn)率為22.56%，多糖含量、浸出物含量、葉長(zhǎng)寬比為主要變異來源。見表5。以第1主成分Y（i，1）＞0且Y（i，2）＞0為入選標(biāo)準(zhǔn)，篩選出浙江建德、浙江臨安、浙江臨海與浙江松陽4個(gè)優(yōu)良種質(zhì)，表現(xiàn)出生長(zhǎng)勢(shì)好，根狀莖發(fā)達(dá)，多糖與浸出物含量高等優(yōu)良性狀。見表6。

表2 加樣回收率試驗(yàn)（n=3）

表3 供試柳葉白前農(nóng)藝性狀、多糖與浸出物含量比較（n=15）

表4 多糖、浸出物含量與農(nóng)藝性狀、經(jīng)緯度、海拔間相關(guān)性分析

表5 入選主成分的特征根值、貢獻(xiàn)率、累計(jì)貢獻(xiàn)率與特征向量

表6 入選優(yōu)良種質(zhì)的主成分值

2.3 聚類分析按照類平均法，依據(jù)D2=7.19的聚類水平，將18個(gè)供試柳葉白前種質(zhì)分為4大類（圖1）。第Ⅰ類群共5個(gè)種質(zhì)，以浙江種質(zhì)為主，分別為浙江建德、浙江松陽、四川峨眉山、浙江臨海與浙江上虞，該類群植株較高或中等高度，莖較粗，葉中等大小較狹長(zhǎng)，根狀莖產(chǎn)量高，多糖與浸出物含量高，篩選的大部分優(yōu)良種質(zhì)歸在此類；第Ⅱ類群共5個(gè)種質(zhì)，分別為浙江蓮都、福建蕉城、江蘇金壇、江蘇溧陽與廣東陽山，該類群植株較高或中等高度，莖較粗，葉片大而寬厚，根狀莖產(chǎn)量高，但多糖與浸出物含量較低；第Ⅲ類群共4個(gè)種質(zhì)，分別為浙江臨安、江西資溪、福建浦城與安徽休寧，該類群浙江臨安種質(zhì)植株生長(zhǎng)勢(shì)好，根狀莖產(chǎn)量于成分指標(biāo)均表現(xiàn)較好，其余種質(zhì)植株較矮，莖較細(xì)，多數(shù)葉片小而狹長(zhǎng)，根狀莖產(chǎn)量低，多糖與浸出物指標(biāo)表現(xiàn)一般；第Ⅳ類群共4個(gè)種質(zhì)，分別為江西臨川、廣西馬山、安徽祁門與廣西田林種質(zhì)，該類群植株中等高度或較矮，莖較細(xì)，葉片大多小而寬厚，根狀莖產(chǎn)量低，多糖與浸出物含量較低。

圖1 柳葉白前種質(zhì)聚類分析圖

3 討論

供試柳葉白前不同種質(zhì)間農(nóng)藝性狀、多糖與醇溶性浸出物含量存在極顯著差異（P＜0.01），表現(xiàn)出較豐富的遺傳多樣性，可作為良種選育的種質(zhì)材料；柳葉白前多糖、醇溶性浸出物含量與產(chǎn)地、農(nóng)藝性狀關(guān)系密切，與葉長(zhǎng)、葉長(zhǎng)寬比、根狀莖直徑與產(chǎn)量呈顯著正相關(guān)，各產(chǎn)地中浙江、四川種質(zhì)多糖與醇溶性浸出物含量較高，其次為江西、廣東、廣西種質(zhì)；12個(gè)供試性狀可簡(jiǎn)化為5個(gè)主成分性狀，累計(jì)貢獻(xiàn)率為91.21%，其中第1主成分主要為農(nóng)藝性狀產(chǎn)量指標(biāo)，以葉長(zhǎng)寬比與根狀莖產(chǎn)量為主，第2主成分為多糖、浸出物含量指標(biāo)；18個(gè)種質(zhì)可劃分為4個(gè)類群，其中類群Ⅰ植株較高，莖較粗，地下部根狀莖發(fā)達(dá)，多糖與浸出物含量高，總體表現(xiàn)較好；柳葉白前良種選育時(shí)，可優(yōu)先在根狀莖發(fā)達(dá)，高葉長(zhǎng)寬比的浙江建德、浙江臨安、浙江臨海與浙江松陽種質(zhì)中選擇。

2015年版《中國(guó)藥典》對(duì)白前藥材質(zhì)量暫無定量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，本試驗(yàn)柳葉白前多糖與醇溶性浸出物含量為6.54%與10.16%，可為后續(xù)柳葉白前藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制訂提供參考。中藥材產(chǎn)地生態(tài)環(huán)境包括水、土壤、生物、氣候等環(huán)境因子，在中藥材生長(zhǎng)發(fā)育過程中各環(huán)境因子間相互影響與關(guān)聯(lián)，本試驗(yàn)對(duì)不同區(qū)域的海拔與柳葉白前多糖、醇溶性浸出物含量進(jìn)行了初步考察，下一步將在優(yōu)良種質(zhì)篩選的基礎(chǔ)上，開展同一區(qū)域內(nèi)不同海拔對(duì)柳葉白前活性成分積累的影響分析，以減少環(huán)境因子間互作關(guān)聯(lián)性的影響。

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（收稿：2016-12-12修回：2017-01-10）

浙江省麗水市人民醫(yī)院藥劑科（麗水323000）

陳健苗，Tel：0578-2780083；E-mail:lstracy1027@163.com