王晨曄 丁彩飛 楊 欣 萬凌屹

復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)患者Hcy水平及MTHFR基因多態(tài)性與中醫(yī)腎虛血瘀型相關(guān)研究

王晨曄 丁彩飛 楊 欣 萬凌屹

目的探討復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)（RSA）患者同型半胱氨酸（Hcy）水平及MTHFR50名基因突變率與中醫(yī)腎虛血瘀型相互關(guān)系。方法檢測50例復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)患者（RSA觀察組）、50名無不良妊娠史的育齡期婦女（健康對照組）血漿Hcy水平、MTHFR基因，中醫(yī)辨證分為腎虛血瘀型及非腎虛血瘀型。結(jié)果RSA觀察組MTHFR基因型頻率純合突變型TT（24/50，48%），顯著高于健康對照組（9/50，18%）；雜合子型CT（22/50，44%）與健康對照組（24/50，48%）比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；健康對照組野生型CC（17/50，34%）顯著高于RSA觀察組（4/50，8%）（P＜0.01）；RSA觀察組MTHFR基因TT型：腎虛血瘀型（13例，26%）＞非腎虛血瘀型（5例，10%）。復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)患者M(jìn)THFR基因TT型相關(guān)性Logistic回歸分析顯示相關(guān)因素中，證型腎虛血瘀型對復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)患者M(jìn)THFR基因TT型影響最大，其他依次為年齡、流產(chǎn)次數(shù)。RSA觀察組患者血漿Hcy（7.32± 0.79）μmol/L，顯著高于健康對照組的（6.10±0.89）μmol/L（P＜0.05）；RSA觀察組患者腎虛血瘀證組Hcy水平顯著高于非腎虛血瘀型[（7.89±0.76）μmol/L比（6.13±0.96）μmol/L，P＜0.05]。結(jié)論MTHFR C677T純合子突變TT型、Hcy水平增高與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)有明確的相關(guān)關(guān)系，且與中醫(yī)腎虛血瘀有相關(guān)性。

復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)；同型半胱氨酸；亞甲基四氫葉酸還原酶；腎虛血瘀

復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)（recurrent spontaneous abortion，RSA），是指2次或2次以上連續(xù)發(fā)生的自然流產(chǎn)，發(fā)生率為5%[1-2]，排除染色體異常、內(nèi)分泌異常、免疫因素、感染因素和解剖因素等常見原因，仍有約50%RSA原因不明[3]。研究[4]表明，凝血相關(guān)基因亞甲基四氫葉酸還原酶（methylentyahydrofotate reductasa，MTHFR），其C677T位點的突變將導(dǎo)致酶活性降低，且同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）水平升高，可引起胎盤栓塞，從而引發(fā)流產(chǎn)。中醫(yī)認(rèn)為，腎虛是先兆流產(chǎn)的首要病機(jī)。腎虛封藏失職，固攝無權(quán)，血海不藏，陰血下漏，血不養(yǎng)胎，胞失腎系則胎元不固；久病瘀血內(nèi)阻胞脈，惡血不去，新血不得歸經(jīng)，腎虛血瘀，從而導(dǎo)致受孕后陰道下血，腹痛下墜，腰骶酸楚，屢孕屢墮[5]。數(shù)墮胎耗氣傷血，沖任受損，加之清宮等金器損傷胞絡(luò)，更加重瘀血形成，因此該病以血瘀為標(biāo)，腎虛為本。本研究通過對RSA患者與無不良妊娠情況的育齡期婦女Hcy水平及MTHFR基因進(jìn)行檢測，研究復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)與Hcy水平及MTHFR基因突變率的相關(guān)性，及其兩者與中醫(yī)腎虛血瘀型及非腎虛血瘀型相互關(guān)系；為臨床采用“補(bǔ)腎活血法”治療RSA高Hcy水平及MTHFR基因突變引起的血栓前狀態(tài)提供理論依據(jù)。

1 臨床資料

1.1 一般資料2015年3月—2016年4月本院生殖科收治符合不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)納入標(biāo)準(zhǔn)[6]的復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者50例為RSA觀察組，平均年齡（31.56±4.82）歲，平均體質(zhì)量（56.67±5.84）kg；擬行孕前檢查的無不良妊娠史的育齡期健康婦女50名為健康對照組，平均年齡（32.12±3.98）歲，平均體質(zhì)量（57.21±4.63）kg。兩組受試者年齡、體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《現(xiàn)代婦產(chǎn)科進(jìn)展——復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的診斷和治療》[7]，及與同一性伴侶連續(xù)遭遇2次或2次以上在妊娠20周前的胎兒（體質(zhì)量≤500g）丟失。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn)RSA觀察組：（1）夫婦雙方外周血染色體核型正常，無家族遺傳病史；（2）經(jīng)檢查排除生殖系統(tǒng)解剖畸形；（3）內(nèi)分泌功能正常；（4）TORCH檢測陰性；（5）抗心凝脂抗體檢測陰性；（6）抗精子抗體（AsAb）檢測陰性；（7）夫婦ABO血型抗體系統(tǒng)檢測IgG抗A抗體、IgG抗B抗體滴度低于1∶64，RH因子陽性。（8）尿HCG陰性。健康對照組：為孕前檢查的育齡期健康婦女，無自然流產(chǎn)史，無不良生產(chǎn)史，尿HCG陰性。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn)（1）合并器質(zhì)性疾病，如心血管、肝、腎和造血系統(tǒng)等嚴(yán)重原發(fā)性疾病者；（2）存在染色體異常、解剖結(jié)構(gòu)異常、內(nèi)分泌失調(diào)、生殖道感染、自身免疫性疾病等病因者；（3）精神病患者；（4）資料不全無法判斷結(jié)果者；（5）尿HCG陽性者。

2 方法

2.1 觀察指標(biāo)

2.1.1 MTHFR基因C677T多態(tài)性檢測PCR反應(yīng)：RT-PCR試劑與引物合成（武漢博士得生物工程有限公司），總蛋白提取試劑盒（SBS Cenetech公司），PCR儀（德國Biometra公司）；MTHFR：C677T引物序列，上游：5'－TGAAGGAGAAGGTGTGTGCGGGA－3'，下游：5'－AGGAGGGTGGGGTGAGAGTG－3'。PCR擴(kuò)增循環(huán)條件：91℃預(yù)變性和變性各2min，56℃退火1min、74℃45s 30個循環(huán)、72℃5min、4℃12h，cDNA產(chǎn)物置于-20℃保存。3%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析。具體試驗操作由我院中心試驗室完成。

2.1.2 血漿同型半胱氨酸測定研究對象于早晨空腹采集靜脈血2mL，EDTA—K3（乙二胺四乙酸三鉀）抗凝，1h內(nèi)送本院檢驗科，采用高效液相色譜法測定完成。

2.2 中醫(yī)辨證分型由我院兩位以上主治中醫(yī)師根據(jù)患者的癥狀、體征、舌苔、脈象，四診合參，根據(jù)中醫(yī)證候診斷標(biāo)準(zhǔn)：參照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》、《中醫(yī)婦科臨床研究》有關(guān)內(nèi)容擬定分為腎虛血瘀型與非腎虛血瘀型[8-9]。所有辨證符合主癥兼具次癥中任一項結(jié)合舌質(zhì)脈象，即可診斷。腎虛血瘀型：主癥：腰膝酸軟；次癥：（1）頭暈耳鳴；（2）面色晦暗；（3）既往月經(jīng)量少或有血塊；（4）夜尿頻數(shù)；（5）潮熱盜汗或畏寒肢冷；（6）眼瞼輕微浮腫；（7）性欲減退；舌脈：舌淡苔白或舌質(zhì)紫暗，舌邊有瘀點或瘀斑，脈沉細(xì)滑或澀或尺脈弱。除腎虛血瘀型之外均為非腎虛血瘀型。

2.3 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS17.0軟件，計量資料以（x±s） 表示，采用t檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。年齡、流產(chǎn)次數(shù)、證型（腎虛血瘀型和非腎虛血瘀型）與MTHFR突變基因TT型的交互作用，采用多元Logistic回歸進(jìn)行分析。

3 結(jié)果

3.1 兩組3種MTHFR基因型頻率分析RSA觀察組純合突變型TT、雜合子型CT、野生型CC分別為24例（48%）、22例（44%）、4例（8%），健康對照組分別為9例（18%）、24例（48%）、17例（34%）。兩組雜合子型CT頻率數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），RSA觀察組純合突變型TT、野生型CC頻率與健康對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

3.2 兩組3種MTHFR基因型與中醫(yī)辨證RSA觀察組腎虛血瘀型比例高于健康對照組（P＜0.01）；RSA觀察組50例中腎虛血瘀型MTHFR基因TT型比例顯著高于非腎虛血瘀型，見表1。

表1 RSA患者與健康對照者M(jìn)THFR基因型（TT、CT、CC）與中醫(yī)辨證（例）

3.3 復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)患者M(jìn)THFR基因TT型相關(guān)性Logistic回歸分析Logistic回歸分析表明，3個相關(guān)因素中腎虛血瘀型對RAS患者M(jìn)THFR基因TT型影響最大，其他依次為年齡、流產(chǎn)次數(shù)，見表2。

表2 RSA患者M(jìn)THFR基因TT型相關(guān)性logistic回歸分析

3.4 兩組血漿同型半胱氨酸水平測定RSA觀察組血漿同型半胱氨酸水平為（7.32±0.79）μmol/L，高于健康對照組的（6.10±0.89）μmol/L（P＜0.05）；RSA腎虛血瘀型患者血漿Hcy水平高于非腎虛血瘀型患者（P＜0.05），見表3。

4討論

導(dǎo)致流產(chǎn)的原因除免疫疾病、內(nèi)分泌異常、組織感染、生物遺傳及生殖道畸形等疾病外，約有50%患者病因不明，稱為不明原因復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)（unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA）[10]。亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）是甲硫氨酸－葉酸代謝中的一個關(guān)鍵酶，人MTHFR基因目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)20余種該基因的突變，其中最常見的是C677T點突變，造成堿基T替換了C，其編碼的氨基酸也由纈氨酸代替了丙氨酸，突變可直接影響酶的活性和耐熱性，從而導(dǎo)致同型半胱氨酸的轉(zhuǎn)硫基和甲基化過程出現(xiàn)障礙，使MTHFR的活性減弱，造成葉酸水平降低及高同型半胱氨酸血癥（HHcy）。妊娠期高同型半胱氨酸血癥可致血液呈高凝狀態(tài)，增加胎盤栓塞危險，可能是復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（recurrent spontaneous abortion，RSA）的發(fā)生機(jī)制[11]。高Hcy血癥還可能引起絨毛膜絨毛血管化不良，造成胚胎死亡，導(dǎo)致流產(chǎn)[12]，另外由于胎盤組織MTHFR活力缺乏，致使作為甲基間接供體的5－甲基四氫葉酸生成障礙，進(jìn)一步影響嘧啶、嘌呤和核酸的代謝及DNA甲基化，使得胎兒發(fā)育必需的生物成分包括DNA和蛋白質(zhì)的甲基化不足，是導(dǎo)致RSA的另一個可能原因[13]。

表3 RSA血漿同型半胱氨酸水平與中醫(yī)辨證分型的關(guān)系（μmol/L，x±s）

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)屬中醫(yī)“滑胎”范疇。其發(fā)病機(jī)制為母體沖任不固及胎元不健，病因病機(jī)多為腎虛，氣血虛弱，血熱及血瘀，且多責(zé)之于腎。腎為先天之本，主生殖，且胞脈者系于腎，若母體腎虛，則胎失所系，導(dǎo)致胎動不安，甚則屢孕屢墜。反復(fù)流產(chǎn)可傷及沖任胞絡(luò)，導(dǎo)致瘀血滯留胞中，再孕后又因精血聚于下以養(yǎng)胎，匯聚之精血又增加氣血運(yùn)行阻力，進(jìn)而又加劇了瘀血形成，瘀血不去，有礙新血?dú)w經(jīng)，不能養(yǎng)胎，最后致胎元不固而流產(chǎn)。腎虛血瘀貫穿復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的全過程[5]。

本研究發(fā)現(xiàn)，RAS患者M(jìn)THFR基因型的分布頻率，TT型顯著高于健康對照組；RAS患者CT型與健康對照組比較，無顯著性差異；健康對照組CC型顯著高于RAS組；提示MTHFR基因型中TT型與RAS密切相關(guān)。RAS患者腎虛血瘀型比例顯著高于健康對照組，提示腎虛血瘀可能是復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的基本病機(jī)之一。同時發(fā)現(xiàn)，復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)組MTHFR基因TT型腎虛血瘀型患者數(shù)＞非腎虛血瘀型患者數(shù)。復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)MTHFR基因TT型相關(guān)性Logistic回歸分析表明，3個相關(guān)因素中，腎虛血瘀型對RAS患者M(jìn)THFR基因TT型影響最大，其他依次為年齡、流產(chǎn)次數(shù)；提示RAS患者M(jìn)THFR基因型中TT型與腎虛血瘀密切相關(guān)。研究還顯示，RAS患者血漿同型半胱氨酸水平（Hcy）顯著高于健康對照組（P＜0.05），其中RAS腎虛血瘀型患者Hcy水平顯著高于非腎虛血瘀型患者。提示RAS與Hcy水平升高有相關(guān)性，Hcy水平與中醫(yī)腎虛血瘀亦存在一定相關(guān)性。

本研究結(jié)果顯示，腎虛血瘀型RAS患者M(jìn)THFR基因TT突變頻率、Hcy血癥均高于非腎虛血瘀型患者，腎虛血瘀可能是其發(fā)生發(fā)展的基本病機(jī)，推測補(bǔ)腎活血法可能成為孕前甚至孕期治療RSA伴MTHFR基因TT突變及高Hcy者的中醫(yī)治法，但臨床還應(yīng)結(jié)合患者的具體癥情進(jìn)行辨證施治，在補(bǔ)腎活血基礎(chǔ)上，兼以補(bǔ)氣、健脾、滋陰、養(yǎng)血、涼血等不同治法，結(jié)合患者的個體情況綜合治療，才能進(jìn)一步提高臨床療效。

（本文受到浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院科研基金資助No.hhyn201501）

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（收稿：2016-05-15修回：2016-12-28）

Relationship between Hcy Levels and the Polymorphism of MTHFR Gene with TCM Type of Kidney Defi－ciency and Blood Stasis in Recurrent Spontaneous Abortion Patients

WANG Chenye,DING Caifei,YANG Xin,WAN Lingyi.
Department of Reproductive Medicine,Integrated Chinese and Western Medicine Hospital of Zhejiang Province,Hangzhou(310003),China

ObjectiveTo investigate the relationship between homocysteine（Hcy）level and MTHFR mutation rate with TCM Kidney Deficiency and Blood Stasis Type in natural recurrent spontaneous abortion patients.MethodsThe level of Hcy and MTHFR gene in 50 recurrent spontaneous abortion patients（observation group）and 50 child-bearing-age women without adverse pregnancy history（control group）were detected.TCM differentiation included kidney deficiency and blood stasis type and non-kidney deficiency and blood stasis type.ResultsTwenty-four out of 50 patients in observation group and 9 women in control group had the TT genotype of MTHFR C677T（48%vs 18%,P＜0.05）;22 patients in observation group and 24 women in control group had the CT genotype（44%vs 48%,P＞0.05）;17 women in control group and 4 patients in observation group had the CC genotype（34%vs 8%,P＜0.05）.Logistic regression analysis result showed that the TT genotype of MTHFR gene played the most important role in the TCM differentiation of kidney deficiency and blood stasis type and non-kidney deficiency and blood stasis type in recurrent spontaneous abortionpatients,followed by age and the number of abortions. The serum level of Hcy in observation group was significantly higher than that in control group（7.32±0.79μmol/L vs 6.10±0.89μmol/L,P＜0.05）;in observation group,the Hcy level of patients with kidney deficiency and blood stasis type was significantly higher than that of patients with non-kidney deficiency and blood stasis type（7.89± 0.76μmol/L vs 6.13±0.96μmol/L,P＜0.05）.ConclusionMTHFR C677T TT homozygous mutant types,the increase of Hcy level and recurrent miscarriage have a clear correlation and are also correlated with the TCM KidneyBlood.

recurrent spontaneous abortion;homocysteine;methylenetetrahydrofolate reductase;kidney deficiency and blood stasis

浙江省中西結(jié)合醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科（杭州310003）

丁彩飛，Tel：13588810881