李靜,石巍，魏曼

(鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科,河南鄭州450052)

性腺激素釋放激素激動劑對子宮內(nèi)膜異位癥在位及異位內(nèi)膜細(xì)胞凋亡的影響

李靜,石巍，魏曼

(鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科,河南鄭州450052)

目的分析子宮內(nèi)膜異位癥在位及異位內(nèi)膜細(xì)胞凋亡受到性腺激素釋放激素激動劑的影響。方法以30例子宮內(nèi)膜異位癥患者為研究對象，均給予體外培養(yǎng)，并利用不同濃度的性腺激素釋放激素激動劑處理在位細(xì)胞和異位細(xì)胞，觀察細(xì)胞生長及細(xì)胞凋亡受到性腺激素釋放激素激動劑的影響情況。結(jié)果子宮內(nèi)膜異位癥在位細(xì)胞核異位細(xì)胞生長率與性腺激素釋放激素激動劑濃度及作用時間呈反比。性腺激素釋放激素激動劑作用24 h后，高濃度在位、異位細(xì)胞凋亡率均高于低濃度，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論子宮內(nèi)膜異位癥在位及異位內(nèi)膜細(xì)胞在性腺激素釋放激素激動劑作用下加速凋亡，可促進(jìn)患者康復(fù)。

性腺激素釋放激素激動劑；子宮內(nèi)膜異位癥；細(xì)胞凋亡

子宮內(nèi)膜異位癥為臨床常見病，多發(fā)于育齡期女性，內(nèi)膜異位至盆腔腹膜為主要發(fā)病部位，卵巢、輸尿管等也可發(fā)病。研究顯示，合并不孕癥的患者約占子宮內(nèi)膜異位癥患者的30%，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[1]。臨床治療子宮內(nèi)膜異位癥時，多采用手術(shù)方式，而在控制病情進(jìn)展、減少術(shù)后復(fù)發(fā)方面，藥物治療具有重要作用，本研究中以收治的子宮內(nèi)膜異位癥患者為研究對象，體外培養(yǎng)在位及異位內(nèi)膜細(xì)胞，并給予性腺激素釋放激素激動劑，觀察期對細(xì)胞凋亡的影響。

1 資料與方法

1.1 臨床資料以本院2014年10月～2015年10月收治的子宮內(nèi)膜異位癥患者30例為研究對象，年齡29～43歲，平均（36.7±2.3）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：均給予手術(shù)治療，術(shù)前未接受激素治療，無其他婦科合并癥，經(jīng)病理學(xué)檢查明確。

1.2 方法

1.2.1 內(nèi)膜細(xì)胞培養(yǎng)方法術(shù)中，每名患者均收治典型卵巢異位內(nèi)膜病灶、子宮在位內(nèi)膜，用于體外培養(yǎng)，培養(yǎng)方法為組織塊消化法。剪碎組織，在37℃下，利用0.1%Ⅳ型膠原酶笑話，時間為2～3 h，完成后，離心細(xì)胞，在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中接種，培養(yǎng)液選擇為改良杜氏伊格爾培養(yǎng)基（內(nèi)含胎牛血清10%、谷氨酸10 mmol/L、胰島素0.1 U/mL、青霉素及鏈霉素各100 mg/mL），培養(yǎng)時間12 h，之后利用倒置顯微鏡進(jìn)行1次細(xì)胞形態(tài)觀察，24 h后，培養(yǎng)液更換，內(nèi)膜細(xì)胞如未貼壁，直接剔除，以后培養(yǎng)液更換時間為2～3 d，細(xì)胞平的80%～90%被細(xì)胞鋪滿時，開始傳代培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞增殖活性檢測方法內(nèi)膜細(xì)胞增殖活性利用四甲胺偶氮唑藍(lán)比色法（MTT）檢測。首先，制動單細(xì)胞懸液，同樣采用改良杜氏伊格爾培養(yǎng)基進(jìn)行，內(nèi)膜細(xì)胞進(jìn)入到對數(shù)生長期后，在96孔培養(yǎng)板中接種內(nèi)膜細(xì)胞，每孔接種密度為1×104個，完成后，于CO2培養(yǎng)箱中放置培養(yǎng)板，進(jìn)行24 h培養(yǎng)。其次，加入性腺激素釋放激素激動劑，劑量濃度分別為100 ng/mL、200 ng/mL，每個濃度中，包含空白孔、對照孔、3個平行孔，培養(yǎng)時間分別為12 h、24 h、36 h、48 h，完成后，將20μLMTT溶液（5 mg/mL）加入到每個孔中，在37℃下，將其放置在培養(yǎng)箱中，繼續(xù)4 h，培養(yǎng)終止，孔內(nèi)上清液去除，再將二甲基亞砜150μL加入到每個孔中，振蕩10 min，充分溶解藍(lán)紫色結(jié)晶物。最后，利用MTT比色，波長570 nm，利用酶聯(lián)免疫檢測儀，將各孔吸光度（A）值測定。

1.2.3 細(xì)胞凋亡率檢測方法細(xì)胞凋亡檢測利用AnnexinV-FITC/PI，利用胰酶消化培養(yǎng)24 h后不同濃度的各孔中的細(xì)胞，洗滌液為磷酸緩沖液，洗滌次數(shù)2次，細(xì)胞混勻采用AnnexinV-FITC/PI與緩沖液進(jìn)行，并記錄細(xì)胞數(shù)量，細(xì)胞濃度調(diào)整為1×104/mL，將AnnexinV-FITC溶液5μL、PI溶液10μL分別加入到100μL懸浮細(xì)胞中，室溫下，進(jìn)行15 min孵育，避免光照，將磷酸緩沖液混勻細(xì)胞400μL加入，數(shù)據(jù)應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS18.0統(tǒng)計分析，計數(shù)資料利用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05表明差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 內(nèi)膜細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果由體外培養(yǎng)結(jié)果可知，30例患者中，成功培養(yǎng)在位內(nèi)膜細(xì)胞29例，成功率96.7%；成功培養(yǎng)異位內(nèi)膜細(xì)胞24例，成功率80.0%。

2.2 在位、異位內(nèi)膜細(xì)胞生長率受性腺激素釋放激素激動劑影響情況由細(xì)胞增殖活性檢測結(jié)果可知，性腺激素釋放激素激動劑濃度越高、培養(yǎng)時間越長時，細(xì)胞生長率越低。見表1。

表1 在位、異位內(nèi)膜細(xì)胞生長率受性腺激素釋放激素激動劑影響情況（%）

2.3 在位、異位內(nèi)膜細(xì)胞凋亡率受性腺激素釋放激素激動劑影響情況由細(xì)胞凋亡率檢測結(jié)果可知，性腺激素釋放激素激動劑濃度為100 ng/mL時，在位、異位細(xì)胞凋亡率均低于濃度為200ng/mL時，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 在位、異位內(nèi)膜細(xì)胞凋亡率受性腺激素釋放激素激動劑影響情況（%）

3 討論

近年來，人們的生活方式發(fā)生了比較大的改變，由此提高了子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病率。子宮內(nèi)膜異位癥多見于育齡期女性，癥狀表現(xiàn)為痛經(jīng)、性交痛、不孕等，對患者身體健康及生活質(zhì)量產(chǎn)生比較大的影響。臨床治療子宮內(nèi)膜異位癥時，多給予患者手術(shù)治療，可將病灶組織有效的清除，并解除盆腔粘連，但深層浸潤病灶無法清除，導(dǎo)致殘留病灶組織，提高了術(shù)后復(fù)發(fā)率，影響患者術(shù)后妊娠[2]。

隨著子宮內(nèi)膜異位癥治療水平的提升，臨床中開始較為廣泛的應(yīng)用性腺激素釋放激素激動劑，取得了良好的治療效果。性腺激素釋放激素激動劑在多種激素依賴性疾病中均有較好的療效，通常認(rèn)為，促性腺激素釋放激素受體在此種藥物的作用下受到調(diào)節(jié)，從而顯著降低促性腺激素以及雌激素水平，發(fā)揮間接性的療效[3]。近年研究顯示，除了下丘腦一垂體軸外，病變組織以及正常組織中也有促性腺激素釋放受體的表達(dá)。

細(xì)胞凋亡中，凋亡刺激信號作用于有核細(xì)胞中，將細(xì)胞內(nèi)的死亡機(jī)制啟動，促使細(xì)胞發(fā)生程序性的變性及壞死。子宮內(nèi)膜細(xì)胞的凋亡可自發(fā)性進(jìn)行，說明內(nèi)膜組織的結(jié)構(gòu)及功能正常，當(dāng)患者患有子宮內(nèi)膜異位癥時，內(nèi)膜組織的結(jié)構(gòu)及功能受到影響發(fā)生異常，從而影響內(nèi)膜細(xì)胞的自發(fā)性凋亡，造成患者病情進(jìn)展[4]。研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜異位癥患者內(nèi)膜中的各個調(diào)控蛋白發(fā)生變化時，在位內(nèi)膜細(xì)胞的凋亡特性也會發(fā)生相應(yīng)的改變[5]。子宮內(nèi)膜細(xì)胞處于增生期時，會增加Bel-2蛋白表達(dá)，與正常子宮內(nèi)膜細(xì)胞相比，Bel-2/bax蛋白比值更高，提高了內(nèi)膜細(xì)胞抵抗凋亡刺激信號的能力，降低內(nèi)膜細(xì)胞凋亡率；內(nèi)膜細(xì)胞處于分泌期時，盡管會降低Bel-2蛋白表達(dá)，而且不會明顯提高Bax蛋白，但與正常分泌期內(nèi)膜細(xì)胞相比，Bel-2/bax蛋白比值依然比較高，從而抑制細(xì)胞凋亡[6]。經(jīng)由本研究的結(jié)果可知，子宮內(nèi)膜異位癥患者在位內(nèi)膜細(xì)胞及異位內(nèi)膜細(xì)胞的凋亡率均會受到性腺激素釋放激素激動劑的影響，而且性腺激素釋放激素激動劑的濃度越高時，細(xì)胞凋亡率越高，這說明，性腺激素釋放激素激動劑的濃度與子宮內(nèi)膜異位癥在位及異位細(xì)胞凋亡率之間成正比。綜上所述，子宮內(nèi)膜異位癥患者在位、異位內(nèi)膜細(xì)胞增殖活性隨著性腺激素釋放激素激動劑濃度及培育時間的增加而降低，細(xì)胞凋亡率則隨之升高，表示子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡與性腺激素釋放激素激動劑之間關(guān)系密切，臨床治療子宮內(nèi)膜異位癥患者時，可給予患者促性腺激素釋放激素激動劑藥物，以提升治療效果。

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