汪成成 ，馮 健，姜 韜 ，王月嬋 ，黃 夏

（1.遼寧省林業(yè)科學(xué)研究院，遼寧 沈陽(yáng) 110032；2.遼寧省林業(yè)調(diào)查規(guī)劃院）

日本落葉松[Larix kaempferi（Lamb.）Carr.]系松科落葉松屬喬木，因其適應(yīng)性強(qiáng)、生長(zhǎng)迅速、成林快、木材用途廣，已成為我國(guó)北方地區(qū)及南方亞高山地區(qū)引種最為成功的造林樹種之一。日本落葉松苗木主要靠播種繁殖，種子主要是從種子園或母樹林獲得。我國(guó)早在1963年就開始了日本落葉松優(yōu)樹選擇和初級(jí)種子園營(yíng)建工作，當(dāng)時(shí)的初級(jí)種子園是利用根據(jù)表型選擇的優(yōu)株?duì)I建成。由于選優(yōu)林地生態(tài)環(huán)境條件較復(fù)雜，所選優(yōu)樹又未經(jīng)過(guò)子代測(cè)定就全部納入種子園的營(yíng)建中，造成了較高的誤選率，并不可避免地影響了種子園的遺傳多樣性。由于組成種子園優(yōu)樹的不同，僅以依靠子代測(cè)驗(yàn)來(lái)評(píng)估種子園的遺傳增益就不能真實(shí)地體現(xiàn)種子園的總體遺傳多樣性，這不利于種質(zhì)資源的保護(hù)和遺傳改良[1-2]。本研究旨在通過(guò)ISSR分子標(biāo)記技術(shù)來(lái)分析日本落葉松2代優(yōu)樹親本的遺傳多樣性。

ISSR分子標(biāo)記技術(shù)是由ZIETKIEWICZ等[3]于1994年創(chuàng)建的一種以PCR擴(kuò)增為基礎(chǔ)的新型分子標(biāo)記技術(shù)，其采用 SSR（simple sequence repeats）對(duì)簡(jiǎn)單重復(fù)序列間的遺傳信息進(jìn)行多態(tài)性擴(kuò)增。因其簡(jiǎn)便迅速、多態(tài)性高、重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物的品種鑒定[4-5]、DNA指紋圖譜構(gòu)建[6-7]、物種分類以及種質(zhì)資源多樣性研究[8-11]等領(lǐng)域，目前未見應(yīng)用在日本落葉松上的報(bào)道。針對(duì)以上情況，本研究欲利用ISSR分子標(biāo)記的方法對(duì)80株日本落葉松2代優(yōu)樹親本的遺傳多樣性進(jìn)行分析，以求在日本落葉松2代種子園的建成中，有較高的遺傳增益和遺傳多樣性。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣品

本次試驗(yàn)的80個(gè)不同的日本落葉松2代優(yōu)樹親本無(wú)性系樣品均采自遼寧省撫順市清原縣大孤家國(guó)營(yíng)林場(chǎng)，樣品采集時(shí)間為2015年7月20日，每個(gè)無(wú)性系均選擇樹體健壯的植株，取樹冠中部針葉，每個(gè)樣品約5g，采集后立即用錫紙包裹，在錫紙上寫好編號(hào)，編號(hào)采用隨機(jī)的方式編寫，最后投入液氮罐帶回實(shí)驗(yàn)室，于-80℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?0個(gè)供試材料的基本情況見表1。

1.2 DNA的提取與檢測(cè)

DNA的提取采用改良CTAB法[12-15]，DNA質(zhì)量的檢測(cè)是用0.8%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)，取部分基因組DNA稀釋到50ng·μL-1，保存于-20℃的冰箱內(nèi)備用。

1.3 ISSR反應(yīng)體系的優(yōu)化建立及引物篩選

試驗(yàn)所用的引物是從加拿大英屬哥倫比亞大學(xué)（UBC）網(wǎng)站公布的96個(gè)ISSR引物中篩選出的，將篩選的引物在日本落葉松樣本的ISSR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序中擴(kuò)增，建立了一套適合日本落葉松的ISSR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序，即ISSR-PCR反應(yīng)體系為 25 μL，其中模板 DNA 2 μL，引物 0.5 μL，dNTPs 0.5 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，Taq 酶 0.5 μL，ddH2O 19 μL。ISSR的 PCR程序?yàn)?95℃預(yù)變性 5 min；95℃變性 30s，50 ℃退火 45s，72 ℃延伸 2 min，循環(huán)45次；最后72℃延伸10 min，4℃保存。

表1 日本落葉松的供試材料Table1 The test materials of Larix kaempferi（Lamb.）Carr.

續(xù)表1

1.4 ISSR擴(kuò)增及電泳檢測(cè)

ISSR-PCR擴(kuò)增在DG-III雙穩(wěn)數(shù)顯電泳儀上進(jìn)行，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結(jié)果用凝膠成像儀檢測(cè)并照相、分析。

1.5 數(shù)據(jù)處理

統(tǒng)計(jì)每一引物對(duì)供試材料所擴(kuò)增的清晰可辨的總帶數(shù)，按擴(kuò)增條帶在相對(duì)遷移位置的有或無(wú)賦值，“有”記為“1”，“無(wú)”記為“0”，構(gòu)建二維數(shù)據(jù)矩陣。根據(jù)ISSR擴(kuò)增的結(jié)果，利用NTSYS-pc version2.1軟件對(duì)統(tǒng)計(jì)的“0/1”數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行分析，得到Dice相似性系數(shù)，并利用UPGMA法進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建樹狀圖[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 ISSR標(biāo)記的遺傳多態(tài)性分析

從96個(gè)ISSR引物中篩選出重復(fù)性好、特異性高、擴(kuò)增效果好的引物8個(gè)（表2），對(duì)80份日本落葉松進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所擴(kuò)增的片段大部分集中在200～1000bp，其中引物807的擴(kuò)增圖譜見圖1～圖3。8個(gè)ISSR引物擴(kuò)增統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表3。8個(gè)ISSR引物共擴(kuò)增出281條DNA條帶，全部為多態(tài)性條帶，多態(tài)性百分率為100%，平均每條引物擴(kuò)增的多態(tài)性條帶數(shù)為35.1。

2.2 基于ISSR標(biāo)記的遺傳相似系數(shù)分析

利用NTSYS-pc version2.1軟件對(duì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行相似系數(shù)計(jì)算，得到相似性系數(shù)矩陣。ISSR擴(kuò)增結(jié)果的遺傳相似性在0.8479～0.9142之間，變幅為0.0663,。其中編號(hào)為C46和C94的遺傳相似系數(shù)最低為0.8479（圖4），表明二者親緣關(guān)系最遠(yuǎn)；編號(hào)為C96和C97的遺傳相似系數(shù)最高為0.9142（圖5），表明二者親緣關(guān)系最近。從相似性系數(shù)可以看出，變幅較小，說(shuō)明所選的材料差異不明顯。

表2 ISSR引物代號(hào)及序列Table2 List of ISSR forward primers and their sequence

2.3 基于ISSR標(biāo)記的聚類分析

基于日本落葉松ISSR遺傳相似性系數(shù)，利用UPGMA法進(jìn)行聚類，獲得聚類樹狀圖（圖6）。當(dāng)相似性系數(shù)在0.856時(shí)，將80個(gè)日本落葉松親本樣本劃分為5個(gè)類群。類群Ⅰ包括65個(gè)樣本，在相似性系數(shù)為0.8635時(shí)該類群可以分為5個(gè)亞類群。其中亞類群Ⅰ-1包括8個(gè)樣本材料；亞類群Ⅰ-2只有編號(hào)為C30這1個(gè)樣本材料；亞類群Ⅰ-3包括29個(gè)樣本材料；亞類群Ⅰ-4包括6個(gè)樣本材料；亞類群Ⅰ-5包括21個(gè)樣本材料。類群Ⅱ包括11個(gè)樣本材料，類群Ⅲ只有編號(hào)為C61和C64這2個(gè)樣本材料；類群Ⅳ和類群Ⅴ分別只有1個(gè)樣本材料。類群Ⅰ中樣本材料占總樣本的81.25%，說(shuō)明這一類群中的日本落葉松無(wú)性系親本遺傳基礎(chǔ)較為狹窄，大部分親本間親緣關(guān)系較近。.

3 結(jié)論與討論

近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，ISSR分子標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于分類學(xué)、品種鑒定、種群遺傳學(xué)研究和構(gòu)建遺傳連鎖圖譜等生物學(xué)領(lǐng)域。因其具有快速、可靠、可以提供有關(guān)基因組豐富信息的DNA等特點(diǎn)，許多學(xué)者將其應(yīng)用到植物的遺傳多樣性研究上。劉桂豐等[17]分析了分布在國(guó)內(nèi)外的12種五針?biāo)傻牡挠H緣關(guān)系，共檢測(cè)出117個(gè)位點(diǎn)，其中多態(tài)位點(diǎn)百分率在9.40%～33.33%之間，利用ISSR分子標(biāo)記構(gòu)建的12種五針?biāo)傻倪z傳關(guān)系聚類圖，在閾值0.358時(shí)將12種五針?biāo)煞譃?個(gè)類群。那冬晨等[18]利用ISSR標(biāo)記對(duì)17個(gè)興安落葉松種源的170個(gè)樣本進(jìn)行了遺傳多樣性分析，并根據(jù)地理距離和遺傳距離對(duì)興安落葉松進(jìn)行了種源間的劃分。李巖[19]應(yīng)用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)分析了涼水國(guó)家自然保護(hù)區(qū)的天然紅松種群在時(shí)間尺度上的遺傳多樣性變化和遺傳分化。隨機(jī)選取的15個(gè)ISSR引物共檢測(cè)出104個(gè)位點(diǎn)，其中多態(tài)位點(diǎn)85個(gè)，多態(tài)位點(diǎn)比率為81.73%，Shannon指數(shù)得出齡級(jí)間遺傳變異為11.96%，Nei指數(shù)得出齡級(jí)間遺傳分化為11.03%。趙秀香等[20]以煙草靶斑病菌基因組DNA為模板，對(duì)采自東北三省煙區(qū)的20個(gè)煙草靶斑病菌菌株進(jìn)行ISSR分析，共擴(kuò)增出132條帶，多態(tài)條帶比率為73.48%，在相似系數(shù)0.74處將其劃分為3個(gè)類群，結(jié)果表明遺傳聚類組群與菌株的地理來(lái)源具有一定的相關(guān)性，而與菌株的致病性無(wú)明顯的相關(guān)性。前人的研究結(jié)果均表明，ISSR分子標(biāo)記技術(shù)能有效揭示品種遺傳多樣性，本研究首次將ISSR分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用到日本落葉松2代優(yōu)樹遺傳多樣性的研究中，分析結(jié)果較理想，達(dá)到了區(qū)分2代優(yōu)樹之間的親源關(guān)系，為日本落葉松2代種子園的營(yíng)建工作提供了幫助，為日本落葉松種質(zhì)資源的開發(fā)和利用、新品種的選育和生產(chǎn)提供了理論依據(jù)。

圖1 引物807對(duì)C21～C40號(hào)日本落葉松DNA的擴(kuò)增結(jié)果Figure 1 Results of amplification using 807 primer for DNAC21－C40

圖2 引物807對(duì)C41～C70號(hào)日本落葉松DNA的擴(kuò)增結(jié)果Figure 2 Results of amplification using 807 primer for DNAC 41－C70

圖3 引物807對(duì)C71～C100號(hào)日本落葉松DNA的擴(kuò)增結(jié)果Figure 3 Results of amplification using 807 primer for DNA C71－C100

表3 ISSR引物擴(kuò)增帶數(shù)及多態(tài)性帶數(shù)Table3 The numbers of primer amplification and polymorphism

圖4 ISSR標(biāo)記的包含編號(hào)C46和C94的部分供試材料之間的相似性系數(shù)Figure 4 Genetic similarity of part of materials include C46 and C94 based on ISSR

圖5 ISSR標(biāo)記的包含編號(hào)C96和C97的部分供試材料之間的相似性系數(shù)Figure 5 Genetic similarity of part of materials include C96 and C97 based on ISSR

圖6 80份日本落葉松ISSR聚類圖Figure 6 The map of cIuster analysis for 80 Larix kaempferi(Lamb.)Carr.by ISSR

通過(guò)利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)分析日本落葉松2代優(yōu)樹間的遺傳多樣性，結(jié)果表明，篩選出的8個(gè)引物對(duì)80個(gè)樣品共擴(kuò)增出281條DNA條帶，全部為多態(tài)性條帶，品種間的遺傳相似性系數(shù)在0.8479～0.9142之間，遺傳多樣性不夠豐富。利用UPGMA法進(jìn)行聚類，在相似系數(shù)為0.856時(shí)，可將80個(gè)日本落葉松種質(zhì)材料劃分為5個(gè)類群。聚類基本符合與子一代的親緣關(guān)系，類群間遺傳基礎(chǔ)較狹窄，親緣關(guān)系較近。

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