李文宏 曾憲成 王捷

miRNA?135a在肝癌組織中的表達及臨床意義

李文宏1曾憲成2王捷3*

目的探討miRNA?135a（miR?135a）在肝癌組織中的表達及其臨床意義。方法采用實時熒光定量PCR檢測20例肝癌組織及其癌旁組織中miR?135a的表達水平，并通過脂質(zhì)體介導的方法將miR?135a模擬物（miR?135amimics）轉(zhuǎn)染肝癌細胞株HepG2，采用實時熒光定量PCR測定轉(zhuǎn)染后細胞中miR?135a的表達水平；通過平板克隆實驗和MTT法分別檢測轉(zhuǎn)染后細胞克隆形成率和存活率的變化，并對miR?135a調(diào)控相關靶細胞的基因表達水平進行檢測，觀察miR?135a在肝癌細胞維持正常功能中的作用。結果通過對20例肝癌組織及其癌旁組織中miR?135a的表達水平進行檢測，結果miRNA?135a的表達在正常組織中相對更高，且兩組之間存在顯著性差異（P＜0.05）；與陰性對照組比較，轉(zhuǎn)染miR?135amimics后HepG2細胞中miR?135a表達水平顯著提高（P＜0.05），而形成單克隆能力和細胞存活率均顯著下降（P＜0.05），同時轉(zhuǎn)染組細胞中與miR?135a細胞調(diào)控相關靶基因FOS、PI3、Jak2、Stat3的mRNA表達量相較于NC組均顯著降低（P＜0.05），表明miR?135a表達提高后抑制細胞形成單克隆能力并降低存活率。結論miR?135a在正常組織和肝癌組織中差異表達，同時當miR?135a表達提高時抑制肝癌細胞形成單克隆能力和降低細胞存活率，表明miR?135a可能通過一些相關靶基因直接或間接調(diào)控HepG2肝癌細胞的存活，在肝癌的發(fā)生過程中可能起到作用，miR?135a可能成為臨床治療肝癌和預后的重要靶點。

miR?135a；HepG2細胞；miR?135amimics；肝癌

前言

微小RNA（microRNA）是近年在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類高度保守的內(nèi)源性RNA，在個體發(fā)育、細胞增殖和凋亡、腫瘤發(fā)生等過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用［1，2］，它主要通過與靶mRNA特異性堿基配對引起靶mRNA的降解或抑制其翻譯，同時它能調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄后表達［3］，參與發(fā)育、造血、器官形成、細胞增殖和凋亡，和腫瘤的發(fā)生過程［4］。目前研究已發(fā)現(xiàn)miRNA與腫瘤、癌癥的發(fā)生存在密切的關聯(lián)，在一些腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)miRNA存在異常表達，造成腫瘤細胞的增殖和遷移［5］。miRNA?135a是miRNA?135家族的重要組成成員，定位于3號染色體p21.1，已發(fā)現(xiàn)其在乳腺癌、結直腸癌、結腸癌、肝癌、惡性腦膠質(zhì)瘤等一系列腫瘤發(fā)生過程中異常表達，同時miRNA?135a與腫瘤細胞的增殖、侵襲密切相關［6-8］。但是miRNA?135a在肝癌組織中的表達及其臨床意義尚未完全明確。

本研究利用Real?time quantification PCR方法檢測臨床20例已確診患者的肝癌組織中miRNA?135a的miRNA表達情況，此外我們利用miRNA?135amimics模擬物轉(zhuǎn)染人肝癌細胞HepG2，并檢測轉(zhuǎn)染后HepG2細胞存活率和形成單克隆細胞能力的變化，同時檢測與miR?135a調(diào)控相關的靶基因FOS、PI3、Jak2、Stat3的表達水平，進而研究miRNA?135a在肝癌中的表達情況以及其在臨床診斷治療中的意義。

1 材料和方法

1.1 肝癌組織標本的收集

肝癌病例組織樣本取自廣州市增城區(qū)人民醫(yī)院（中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院增城院區(qū)）普外科腫瘤標本庫2014年1月至2015年12月手術切除癌變組織的肝癌患者20例，其中男性13例，女性7例，年齡范圍為32～73歲，平均年齡為52.0±0.5歲。所取樣本均經(jīng)過病理學證實，每例標本大小約為1 cm× 1 cm×1 cm，另取上述與其配對的同一患者癌旁的正常肝組織（距離肝癌組織邊緣約2～3 cm以外，經(jīng)過病理證實無腫瘤細胞浸潤）作為對照組，20例患者術中、術前均未接受放療、化療及免疫治療，標本收集經(jīng)過廣州市增城區(qū)人民醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，患者及其家屬均知情同意。所取標本均在離體后30min內(nèi)經(jīng)過無菌無核酸酶水沖洗后置于凍存管，液氮迅速冷凍后放入-80℃冰箱中保存。

1.2 試劑和儀器

RNA提取試劑盒購于廣州永諾生物科技有限公司，熒光定量PCR試劑盒購于TAKARA（日本）；轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司，HepG2細胞株購自廣州永諾生物科技有限公司，MTT購自美國Sigma公司，人miRNA?135a模擬物（miR?135amimics）序列UAUGGCUUUUUAUUC?CUAUGUGA、miRNA?135a模擬物陰性對照（nega?tive control，miR?135a mimics NC）序列UUCUCC?GAACGUGUCACGUTT，均購自廣州永諾生物科技有限公司；儀器為美國Bio?Rad熒光定量PCR儀；引物設計與合成由深圳華大基因研究院提供。

1.3 miR?135a在肝癌組織與正常癌旁組織中的表達

1.3.1 組織中總RNA的提取使用廣州永諾生物科技有限公司試劑盒提取總RNA，分別稱取100mg肝癌組織及癌旁組織，常溫下加入裂解液1mL篩網(wǎng)研磨，吸取裂解液后加入氯仿混勻；4℃下離心后留取上清液約400μL，加入等體積聚合液后混勻倒入內(nèi)置管，經(jīng)過洗脫液2次洗脫，4次高速離心交叉進行，將內(nèi)置管套入新的Ep管中，在膜中央加入5μLRNase?free H2O，靜置1min后離心獲得總RNA，用分光光度計檢測收集到RNA的OD260/280值。

1.3.2 實時熒光定量PCR（Real?time quantification PCR）實時熒光定量反應采用廣州永諾生物科技有限公司miRNA Real?time PCR Assay Kit實時定量反應體系，采用美國Bio?Rad實時反應PCR儀進行擴增反應。以U6作為內(nèi)參，檢測miRNA?135a的表達。反應體系中所用的引物如下：

miRNA?135a F：5′?TGCTTTGTCTACATTTGG?GA?3′

miRNA?135a R：5′?ATTCTAACATTTCTCACAT TCA?3′

內(nèi)參U6 F：5′?CGCTTCGGCAGCACATATAC?3′

R：5′?TTCACGAATTTGCGTGTCAT?3′。

反應體系的總體積為20μL，其中包含2× miRNA qPCR Mix（With SYBR Green）10μL，正向引物（Forward primer）0.4μL，濃度10μM，反向引物（Reverse primer）0.4μL，濃度10μM，剩余體積用雙蒸水補齊。實時熒光定量PCR反應條件為94℃預變性3 min，然后94℃20 s、60℃20 s和72℃40 s進行40個循環(huán)。

1.4 miRNA?135amimics模擬物轉(zhuǎn)染HepG2細胞及其對細胞形成單克隆能力和存活率的影響

1.4.1 細胞培養(yǎng)及miRNA?135amimics轉(zhuǎn)染人肝癌細胞株HepG2用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，并置于37℃恒溫、5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，傳代培養(yǎng)至細胞對數(shù)生長期，隨機將細胞分成轉(zhuǎn)染陰性對照組（negative control，NC）和轉(zhuǎn)染miRNA?135amimics組。取對數(shù)生長期的HepG2細胞，PBS洗滌2次，0.25%胰酶消化后，加入含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基吹打成細胞懸液，并進行細胞計數(shù)，調(diào)整細胞濃度至1×105個細胞/mL，將HepG2細胞接種到6孔培養(yǎng)板上，12 h后細胞達到80%～90%的融合后進行轉(zhuǎn)染。

用250μL無血清培養(yǎng)基分別稀釋LipofectamineTM2000（5μL）和miRNA?135amimics（5μL）或陰性對照mimics（5μL）。溫育5min后混合稀釋好的LipofectamineTM2000和mimics，用手指彈勻，溫育25min后分別加入細胞培養(yǎng)液。細胞在37℃、5% CO2中孵育6 h后更換正常細胞培養(yǎng)基，HepG2細胞繼續(xù)培養(yǎng)60 h。陰性對照組和轉(zhuǎn)染組HepG2細胞用0.25%的胰酶消化并離心。PBS液重懸細胞并轉(zhuǎn)移至EP管中（每組各收集1管），10 000×g離心5min。各EP管內(nèi)加入細胞裂解液（8mol/L尿素，4%CHAPS，5mL/L 2%Bio?lyte，1%TBP）300μL，冰浴30 min（期間振蕩2～3次）后15 000×g離心30 min。上清液采用Branford法測定蛋白濃度。重復細胞轉(zhuǎn)染過程并分批收集細胞3批。

1.4.2 平板克隆形成實驗檢測細胞的單克隆形成能力細胞計數(shù)后，將細胞稀釋成1×104cell/mL，再稀釋成1×103cell/mL接種于96孔板，分別吸取50μL接種即50個cell/孔，100μL接種即100個cell/孔，200μL接種即200個cell/孔。每組細胞設立3個平行復孔。然后讓細胞在含10%FBS的DMEM（高糖）培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天，最后用結晶紫染色細胞克隆。此實驗重復3次，結果中平板為1次代表性的結果。計算克隆形成率%=（單克隆細胞數(shù)÷接種細胞數(shù)）×100%。

1.4.3 MTT實驗檢測miR?135a mimics轉(zhuǎn)染后HepG2細胞存活率在實驗前一天將細胞以1× 105cell/mL的密度接種于96孔板，100μL/孔，培養(yǎng)12 h后待細胞貼壁，每孔加入MTT溶液10μL，反應4 h后棄去培養(yǎng)液，加入DMSO 150μL/孔，用酶標儀檢測490 nm波長處的吸光值，此實驗重復3次，計算細胞存活率（%）=（實驗OD值?空白對照組OD值）/（對照組OD值?空白對照組OD值）×100%。

1.5 實時熒光定量PCR檢測轉(zhuǎn)染后細胞miRNA?135a相關調(diào)控靶基因表達

HepG2細胞轉(zhuǎn)染miRNA?135a后，利用實時熒光定量PCR檢測在miRNA?135a表達提高的情況下相關調(diào)控靶基因FOS、PI3、Jak2、Stat3的mRNA表達水平。四種基因和內(nèi)參基因引物序列如表1所示。反應體系的總體積為20μL，其中包含2× miRNA qPCR Mix（With SYBR Green）10μL，正向引物（Forward primer）0.4μL，反向引物（Reverse primer）0.4μL，miRNA 0.5μL，剩余體積用雙蒸水補齊。實時熒光定量PCR反應條件為94℃預變性3min，然后94℃20 s、60℃20 s和72℃40 s進行40個循環(huán)。

表1 FOS、PI3、Jak2、Stat3基因引物序列

1.6 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計學分析

待測miRNA的表達量采用2?△△CT法確定，實驗結果使用SPSS 19.0軟件進行分析，數(shù)據(jù)用平均值±標準誤表示，計量資料先進行方差齊性檢驗，進一步的組間表達比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 miRNA?135a在肝癌組織中的表達

利用實時熒光定量PCR技術測定20例肝癌病例組織與正常癌旁組織中的miRNA?135a表達水平，以距離肝癌組織邊緣2～3 cm的正常組織（癌旁組織）作為對照組。結果顯示（如表2及圖1散點圖所示），miRNA?135a在正常組織和肝癌組織中均有表達；將癌旁正常組織和肝癌組織兩組樣本用獨立樣本的t檢驗進行統(tǒng)計分析，miRNA?135a的表達在正常組織中相對更高，且兩組之間存在顯著性差異（P＜0.05）。

表2 20例臨床肝癌組織中m iRNA?135a的表達水平

2.2 轉(zhuǎn)染后HepG2細胞中miR?135a的表達水平

人肝癌細胞株HepG2細胞隨機分為轉(zhuǎn)染陰性對照組（negative control，NC）、轉(zhuǎn)染miRNA?135a inhibitor組和轉(zhuǎn)染miRNA?135a mimics組，轉(zhuǎn)染48 h后分別收集inhibitor及mimics組細胞，采用實時熒光定量PCR檢測miRNA?135a的表達。結果顯示，miR?135a在陰性對照組HepG2細胞中的本底表達較低，幾乎難以被檢測到。細胞株內(nèi)miR?NA?135a含量太低，抑制miRNA?135a無意義，取消抑制組。而轉(zhuǎn)染后細胞中miRNA?135a的表達水平相較于陰性對照組（NC）顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），如圖2?？梢姡D(zhuǎn)染后肝癌細胞miRNA?135a表達提高。

圖1 20例肝癌及癌旁組織中m iRNA?135a表達散點圖

圖2 m iRNA?135a在轉(zhuǎn)染后HepG2細胞中的表達

2.3 miRNA?135a轉(zhuǎn)染對HepG2細胞單克隆形成能力和細胞存活率的影響

為研究轉(zhuǎn)染miRNA?135a對HepG2肝癌細胞克隆形成率的影響，采用平板克隆形成實驗（PCF）檢測兩組細胞形成單克隆的能力。NC組和轉(zhuǎn)染組HepG2細胞培養(yǎng)后分別計數(shù)，各吸取兩組細胞50、100、200個細胞接種于96孔板中，兩組細胞克隆形成率如表3所示，圖3為三次平板實驗中具有代表性的一次結果。結果顯示，HepG2細胞轉(zhuǎn)染miRNA?135amimics后細胞形成率明顯減少（接種細胞個數(shù)50，P＜0.05；接種細胞個數(shù)100，P＜0.05；接種細胞個數(shù)200，P＜0.05），不同細胞接種數(shù)下兩組細胞的克隆形成率差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）?？梢姡琀epG2細胞中miRNA?135a表達量升高時會降低細胞形成單克隆的能力。

圖3 NC組和轉(zhuǎn)染組HepG2細胞平板克隆形成情況

采用MTT比色法測定轉(zhuǎn)染后HepG2細胞的存活率，如圖4，結果顯示，HepG2轉(zhuǎn)染miRNA?135amimics后，第一天細胞存活率（48.5±0.7）%相較于NC組（51.0±1.3）%（F=0.576，P＞0.05），第二天細胞存活率（67.2±1.0%）相較于NC組（72.9±3.3）%（F=6.622，P＞0.05）無顯著差異，第三天細胞存活率（78.5±1.4）%相較于NC組（92.0±2.2）%（F= 1.535，P＜0.05）顯著下降?？梢娹D(zhuǎn)染miR?135a的HepG2細胞存活率明顯下降。

2.4 調(diào)控miR?135a相關靶基因的表達

miRNA?135a模擬物轉(zhuǎn)染HepG2肝癌細胞，進一步檢測miR?135a表達提高對相應靶基因FOS、PI3、Jak2、Stat3表達的影響。如圖5所示，轉(zhuǎn)染組細胞中FOS、PI3、Jak2、Stat3的mRNA表達量相較于NC組均顯著降低（P＜0.05）。

表3 轉(zhuǎn)染m im ics后HepG2細胞克隆形成率

表3 轉(zhuǎn)染m im ics后HepG2細胞克隆形成率

注：與NC組比較：*P＜0.05，**P＜0.01

細胞接種數(shù)/個50 100 200 NC組單克隆形成率/% 44.5±0.41 48.2±0.24 50.5±0.67 mimics組單克隆形成率/% 8.7±0.26**11.8±0.24**14.3±0.56**

圖4 NC組和轉(zhuǎn)染組HepG 2細胞存活率

3 討論

圖5 HepG2細胞中m iR?135a可能調(diào)控靶基因mRNA水平

由于腫瘤基因治療和分子靶向治療手段上的發(fā)展和進步，目前對肝癌治療的研究在用藥、化療聯(lián)合靶向基因治療方面非?；钴S。miRNA是一類能調(diào)控基因表達的因子，與癌癥的發(fā)生發(fā)展高度相關，人類腫瘤中存在miRNA的失衡表達，miRNA在不同類型的腫瘤中表達情況不同［9，10］。miR?135家族編碼三個miRNAs定位于染色體3p21.1、12q23.1、1q32.1，其中miR?135a是miR?135家族的重要成員之一［11］，在以往的研究中發(fā)現(xiàn)，miR?135a與癌癥細胞的增殖、遷移、侵襲有關。

本研究通過檢測miR?135a在20例肝癌組織及其癌旁組織中的表達，發(fā)現(xiàn)miR?135a在肝癌組織與癌旁組織中差異表達，且有3組樣品miR?135a的表達在肝癌組織中顯著高于相對應的癌旁組織，15組樣品miR?135a的表達在癌旁組織中顯著高于肝癌組織，這就提示miR?135a可能與肝癌的發(fā)生機制相關，也可能成為肝癌診斷和預后的一個重要指標，Shin等人發(fā)現(xiàn)miR?135a在胃癌中的表達量與臨床分期呈現(xiàn)負相關［12］，這就預示著miR?135a在腫瘤中的表達量與患者的臨床分期、治療情況密切相關；我們利用miR?135a轉(zhuǎn)染人肝癌細胞HepG2，發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)miR?135a的表達量顯著提高，同時細胞形成單克隆能力和細胞存活率均顯著下降，說明肝癌細胞中過表達miR?135a會抑制腫瘤細胞的增殖，起到抑癌的作用。殷保兵等人發(fā)現(xiàn)miR?135a在膽囊癌中具有抑癌作用，且在膽囊癌組織中呈現(xiàn)低表達，在膽囊癌細胞中過表達miR?135a可通過G1期阻滯抑制腫瘤細胞的增殖，且可能是通過調(diào)控VLDLR基因?qū)崿F(xiàn)的［13］，Tang等人發(fā)現(xiàn)miR?135a通過調(diào)節(jié)HOXA10的表達在卵巢上皮癌中發(fā)揮抑癌的作用［8］。本研究發(fā)現(xiàn)當過表達miR?135a時FOS、PI3、Jak2、Stat3表達均受到抑制，Wu等人發(fā)現(xiàn)miR?135a能抑制胃癌細胞的增殖，進一步探究其靶向基因的表達，發(fā)現(xiàn)miR?135a直接影響Jak2的表達，Jak2是細胞因子通路中的一種細胞質(zhì)酪氨酸激酶，miR?135a表達上調(diào)時直接導致Jak2表達下調(diào)并減少Sata3激活，說明Jak2和Stata3均是miR?135a發(fā)揮抑癌作用的靶向基因［14］。因此可以推斷miR?135a過表達降低肝癌細胞的存活起到抑制肝癌發(fā)生的作用，并且這些生物學功能的改變是因為miR?135a過表達引起細胞內(nèi)相關靶基因表達水平改變所致。本研究表明miR?135a在肝癌細胞中與正常組織中存在差異表達，且在肝癌細胞的發(fā)生進程中起到抑制作用，它可能成為肝癌生物治療中的一個候選靶點。

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Expression ofm iRNA?135a in the Hepatic carcinoma and its clinical significance

Objective To explore the expression ofmiRNA?135a（miR?135a）in the hepatic carcinoma and its clinical significance.M ethods The level of expression ofmiR?135a in the hepatic carcinoma tissues of 20 patients with hepatic carcinoma and the commensurate adjacent normal liver tissueswere detected by real?time quantitation PCR.HepG2 cellswere transfected withmiR?135amimics mediated by liposomal transfection reagent and the expression of miR?135a in the transfected HepG2 cellswere detected by real?time quantitation PCR.The changesof cell clone formation ratand cellviability were analyzed by tablet clone formation experiment（PCF）and MTTmethod，respectively.Meanwhile，the expression of the related genes ofmiR?135a regulation were analyzed to discover the role ofmiR?135a in maintain normal function.Results The miR?135a was detected in both hepatic carcinoma and commensurate adjacent normal liver tissues.The expression ofmiR?135a in the commensurate adjacentnormal liver tissues were significantly higher than that in the hepatic carcinoma（P＜0.05）.Compared with negative control，the expression ofmiR?135a in themiR?135amimics transfected HepG2 cellswas significantly increased（P＜0.05），however，the clone formation rate and viability were significantly decreased（P＜0.05）.And the expression ofmiR?135a regulation related genes including FOS，PI3，Jak2，Stat3 were all down regulated（P＜0.05）.These data suggested that the up?regulated ofmiR?135a could inhibited the clone formation rate and decrease the cell viability.Conclusion miR?135a was differently expression in hepatic carcinoma and normal liver tissues and the up?regulated ofmiR?135a could inhibited the clone formation rate and decrease the cell viability.miR?135a contributed to the viability and occurrence of hepatic carcinoma by regulated of the related genes directly or indirectly，miR?135amay became the important target for clinical treatmentand prognosis ofhepatic carcinoma.

miR?135a；HepG2；miR?135amimics；Hepatic carcinoma

R735.7

A

10.3969/j.issn.1009?976X.2017.03.002 LIWenhong1，ZENG Xiancheng2，WANG Jie3.1Department ofGeneralSurgery，Zengcheng People′s Hospital，Guang?zhou 511300，China；2Department of General Surgery，the 2nd Provincial Hospital of Guangdong，Guangzhou 518037，China；3Department ofHepatobiliary and Pancreatic Surgery，Sun Yat?sen Memorial Hospital，Sun Yat?sen University，Guangzhou 510120，China.Corresponding author：WANGJie，sumsjw@ 163.com

2017-03-19）

2014年廣州市醫(yī)藥衛(wèi)生科技一般引導項目（20141A010111）；廣州市增城區(qū)人民醫(yī)院青年醫(yī)學人才培育基金（2015-QN-004）；廣州市科技計劃項目（2013J4100081）；廣州市衛(wèi)生局項目（20141A011117；20151A011112）；國家自然科學基金（81372565）

1511300廣州增城區(qū)人民醫(yī)院普外科；2518037廣州廣東省第二人民醫(yī)院普外二科；3510120廣州中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院肝膽胰外科

*通訊作者：王捷，E?mail：sumsjw@163.com