張曉川 唐樹堯 李吉友 陳志男 侯利民 葉振宇

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移植物抗腫瘤效應(yīng)抗大腸癌的實(shí)驗(yàn)研究

張曉川 唐樹堯 李吉友 陳志男 侯利民 葉振宇

目的 通過移植物抗腫瘤效應(yīng)和相關(guān)的細(xì)胞因子共同作用，建立一套綜合的大腸癌輔助治療方案。方法 對BALB/C小鼠的皮下注射CT26腫瘤細(xì)胞來建立結(jié)腸癌小鼠模型，將CT26腫瘤模型鼠隨機(jī)分組治療，記錄它們的存活天數(shù)、腫瘤大小、腫瘤生長抑制率。結(jié)果 免疫細(xì)胞移植聯(lián)合環(huán)磷酰胺(CP)治療組的存活天數(shù)為(34.9±2.75)天，未治療組存活天數(shù)(15.4±2.50)天(P<0.01)。聯(lián)合治療組腫瘤抑制率為94.3%。單獨(dú)的CP治療組和免疫細(xì)胞移植組腫瘤抑制率分別為99.4%和74.4%。結(jié)論 免疫細(xì)胞移植存在(GVT)效應(yīng)，有益于腫瘤的治療，是潛在的細(xì)胞免疫治療實(shí)體瘤的新方法。

移植物抗腫瘤效應(yīng)(GVT)；大腸癌；同種異基因脾免疫細(xì)胞輸注移植(DLI)；環(huán)磷酰胺(CP)

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:875～878)

大腸癌是1種常見的嚴(yán)重威脅人類生命健康的惡性腫瘤，腫瘤免疫學(xué)各種學(xué)說的提出，使其成為新的研究熱點(diǎn)[1]。近幾年，利用激活免疫系統(tǒng)，打破原有的免疫耐受的機(jī)理來抗腫瘤的作用已經(jīng)被廣泛應(yīng)用在臨床中，例如乳腺癌[2]?，F(xiàn)有的腫瘤靶向的免疫治療被認(rèn)為是較為安全和有效的手段，并且可以彌補(bǔ)長期放化療對患者免疫系統(tǒng)的損傷[3]。利用自體淋巴細(xì)胞的移植，目前被認(rèn)為可能對腫瘤治療有效。然而，由于體外增殖，取材的困難，加之患者的免疫耐受和細(xì)胞傳代中的污染等多方面問題可能導(dǎo)致腫瘤的復(fù)發(fā)，因此在臨床中較少應(yīng)用[4]。目前，關(guān)于免疫細(xì)胞移植(DLI)的異基因細(xì)胞免疫方面的研究正在迅速發(fā)展。異基因移植所引起的細(xì)胞免疫彌補(bǔ)了傳統(tǒng)腫瘤免疫過程中副損傷大的缺點(diǎn)，并且提供了較強(qiáng)的的腫瘤殺傷力[5]。本實(shí)驗(yàn)中，我們用脾細(xì)胞作為供體免疫細(xì)胞。因?yàn)槠⒅泻写罅苛馨图?xì)胞和少量造血干細(xì)胞，并且是天然的免疫器官。與其他移植相比，脾細(xì)胞移植有著操控性強(qiáng)，步驟簡化，供者及受者并發(fā)癥少的優(yōu)點(diǎn)。因此，脾細(xì)胞誘導(dǎo)GVT有著較好的前景。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物材料

受體小鼠32只(雌性)，供體鼠10只(雄性)，選自同種系BALB/C鼠，平均年齡8～10周，平均體重18～22克(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)。 CT26結(jié)腸癌細(xì)胞(CRL-2638)由上海傅孟基因生物技術(shù)公司購買。CT26腫瘤細(xì)胞在含有10%牛胚血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，并在37°C溫箱中培養(yǎng)使其達(dá)到指數(shù)增生期。牛胎血清補(bǔ)體滅活。

1.2 脾細(xì)胞懸液的制備和移植

1.2.1 制備懸液 供體近交系BALB/c(H2d)小鼠采用1%戊巴比妥鈉溶液腹腔內(nèi)注射麻醉，無菌條件切取脾臟置于10%肝素鈉鹽水溶液中，將脾臟組織反復(fù)剪切后經(jīng)200目鋼網(wǎng)濾過，濾過液加入5 ml淋巴細(xì)胞分離液，離心15 min，吸取中層液體加入1640培養(yǎng)液5 ml漂洗一次，再次加入1640培養(yǎng)液5 ml，即為脾細(xì)胞懸液。

1.2.2 細(xì)胞計(jì)數(shù) 吸取稀釋后的細(xì)胞懸液，滴加在計(jì)數(shù)板上，讓其自然流入計(jì)數(shù)池內(nèi)，靜止2 min，在顯微鏡下計(jì)數(shù)。細(xì)胞總數(shù)(個(gè)/ml)=四大格細(xì)胞總數(shù)÷4×10000×稀釋倍數(shù)，根據(jù)計(jì)算結(jié)果將細(xì)胞懸液稀釋為(1.5～2.0)×107/ml。

1.2.3 鑒別細(xì)胞活力的方法 吸取0.5 ml細(xì)胞懸液,滴加0.4%胎盼藍(lán)染液0.5 ml,混勻染色2 min，吸取1滴顯微鏡下觀察，藍(lán)染者為死亡細(xì)胞。隨機(jī)選取7～10個(gè)視野，計(jì)數(shù)1 000個(gè)細(xì)胞，得出活細(xì)胞的比例。

1.2.4 脾細(xì)胞移植 移植前3周將供體小鼠的脾細(xì)胞懸液1 ml[細(xì)胞總數(shù)為(1.0～2.0)×107/ml;細(xì)胞活力≥95%]經(jīng)尾靜脈輸注到受體小鼠體內(nèi)。接受脾細(xì)胞移植的小鼠出現(xiàn)皮膚紅斑、脫毛、腹瀉、體重減輕時(shí)，判為移植物抗宿主反應(yīng)。

1.3 小鼠大腸癌模型的建立

用1.25 g/L胰蛋白酶溶液收獲處于指數(shù)生長期CT-26細(xì)胞,吹打成單細(xì)胞懸液,用Hank's平衡鹽溶液(HBSS)洗滌并重懸.用臺盼藍(lán)(trypan blue)清除試驗(yàn)鑒定,具有90%以上活力的單細(xì)胞懸液用于下一步實(shí)驗(yàn)，各組小鼠右側(cè)腋窩皮下接種1×106個(gè)CT-26小鼠大腸腺癌細(xì)胞，接種腫瘤細(xì)胞以后觀察各組小鼠的生存時(shí)間,監(jiān)測小鼠腫瘤體積變化。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組情況

用1.25 g/L胰蛋白酶處理CT26腫瘤細(xì)胞，并且臺酚藍(lán)染色，濾過壞死細(xì)胞，制成90%以上存活率的單細(xì)胞懸液。在每組小鼠右側(cè)的腋下皮下注射CT26腫瘤細(xì)胞。觀察小鼠的存活天數(shù)，腫瘤大小和體格情況。

雌性BALB/C系鼠，在第3、14、21、28天經(jīng)尾靜脈輸注脾細(xì)胞。

接種CT26腫瘤細(xì)胞小鼠被隨機(jī)分為4組，每組8只A組(不加治療對照組)：小鼠注射CT-26大腸癌細(xì)胞株+生理鹽水注射；B組(環(huán)磷酰胺化療組)：小鼠注射CT-26 大腸癌細(xì)胞株+腹腔注射100 mg/kg環(huán)磷酰胺(CP)；C組(DLI治療組)：同種異基因脾細(xì)胞輸注+3周后小鼠注射CT-26 大腸癌細(xì)胞株+同種異基因脾細(xì)胞輸注；D組(聯(lián)合治療組：DLI+CP)：同種異基因脾細(xì)胞輸注+3周后小鼠注射CT-26大腸癌細(xì)胞株+同種異基因脾細(xì)胞輸注+環(huán)磷酰胺注射。

1.5 病理學(xué)檢查

實(shí)驗(yàn)組取特定時(shí)間處死的小鼠，取皮下腫瘤組織病理切片，取材、固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、染色、封片等幾個(gè)主要步驟,并放大1000倍，進(jìn)行移植物抗宿主病病理分級并計(jì)算抑瘤率。

1.6 數(shù)據(jù)采集

存活天數(shù)為CT26癌細(xì)胞接種至死亡的天數(shù)。腫瘤抑制率為主要的評估腫瘤生長的方法，每天測量腫瘤的長短徑。 腫瘤大小=長徑×短徑；腫瘤生長抑制=(未治療組腫瘤大小-治療組腫瘤大小)-未治療組腫瘤大小×100%。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 腫瘤模型和生存狀況

接種CT26大腸癌細(xì)胞后3～5天的小鼠，腫瘤開始明顯生長，在光鏡下進(jìn)行觀察,放大1000倍。

由表1可見，A組生存天數(shù)最短(15.4±2.50)d，B組為(25.5±4.00)d，C組為(19.4±3.42)d，說明CP和DLI對C726腫瘤有作用。D組存活天數(shù)最長(34.9±2.75)d，說明CP和DLI聯(lián)合治療的有效性。

B組和D組腹腔注射CP后，出現(xiàn)明顯的體重減輕、脫毛、行動(dòng)遲緩等癥狀，C組和D組中應(yīng)用DLI的小鼠出現(xiàn)皮膚干皺、活動(dòng)遲緩，并在治療過程中逐漸惡化。然而沒有因移植排斥反應(yīng)而死亡的個(gè)體。

表1 不同組別小鼠的生存狀況

注：a為與A組比較，P<0.01；b為與B組比較，P<0.01；c為與C組比較，P<0.01。

2.2 腫瘤生長狀況

四組中的腫瘤生長狀況呈現(xiàn)明顯的不同，接種腫瘤細(xì)胞3天后，腫瘤開始在右腋下接種部位明顯生長。A組中生長最快，C組中生長最慢。B組和D組中經(jīng)CP治療后3天腫瘤逐漸變小甚至消失。然而，B組腫瘤在CP停藥后3天開始逐漸長大。D組中腫瘤在停藥后第5天逐漸長大，見表2。

表2 3天后不同組小鼠的腫瘤體積及腫瘤抑制率

注：a為與 A組比較，P<0.01；b為與B組比較，P<0.01；c為與C組比較，P<0.01。

2.3 組織病理學(xué)改變

四組小鼠的腫瘤組織中存在不同程度的出血壞死。B組小鼠腫瘤組織中存在明顯的細(xì)胞增大。D組小鼠腫瘤組織中淋巴濾泡大量增殖。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)中，時(shí)間的關(guān)鍵點(diǎn)是CT26腫瘤細(xì)胞接種后第3天，此時(shí)腫瘤的大小可明顯觀察到。因此，不同治療組的治療藥物從第3天開始添加。Zinocher團(tuán)隊(duì)[6]研究發(fā)現(xiàn)時(shí)間點(diǎn)的選取對免疫性治療和化學(xué)治療的治療效果有關(guān)鍵性的影響。我們發(fā)現(xiàn)第3～5天免疫接種的適當(dāng)?shù)臅r(shí)機(jī)。因此，在第3天化療后進(jìn)行免疫接種，可以避免小鼠過早死亡。

目前，淋巴細(xì)胞的移植仍然局限在實(shí)驗(yàn)階段。盡管有實(shí)驗(yàn)說明移植物對腫瘤有治療效應(yīng)，但使之應(yīng)用于臨床還存在很多困難。 Moscovith團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)異源的淋巴細(xì)胞在原發(fā)性淋巴瘤和轉(zhuǎn)移性乳腺癌中有抗腫瘤作用[7]。此外，移植異源基因誘發(fā)GVT抗腫瘤的作用被認(rèn)為是免疫治療的最有效手段[8]。臨床上已有利用異基因移植治療卵巢癌、前列腺癌、直腸癌，胰腺癌的報(bào)道。綜上所述，在實(shí)體瘤的研究中，移植物抗腫瘤的效應(yīng)可能是腫瘤治療的新突破。

應(yīng)用異源淋巴細(xì)胞取代造血干細(xì)胞目的是抑制免疫反應(yīng)。同時(shí)保持受體的造血功能。值得注意的是，治療前并未對小鼠進(jìn)行照射。因?yàn)樵诮?jīng)照射的小鼠會(huì)出現(xiàn)淋巴細(xì)胞輸注后的骨髓抑制[9]。

環(huán)磷酰胺(CP)是目前應(yīng)用廣泛的化療藥物[10]。CP主要作用于細(xì)胞有絲分裂周期，抑制DNA的合成，因此可以抑制T細(xì)胞分化和B細(xì)胞產(chǎn)生抗體。T細(xì)胞和B細(xì)胞對CP高度敏感，然而Th細(xì)胞和效應(yīng)T細(xì)胞對CP不敏感。因此，CP主要抑制體液免疫而非細(xì)胞免疫。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)對異源脾細(xì)胞輸注后的小鼠用CP進(jìn)行預(yù)處理可誘發(fā)輕微的免疫耐受。在小鼠的植皮實(shí)驗(yàn)中，由于主要組織相容性復(fù)合體(MHC)的差異導(dǎo)致異源物移植和CP聯(lián)合治療不能延長小鼠的生存期。因此，這種治療方式只適用于對免疫耐受較差的腫瘤小鼠的生存期的延長。

鑒于Suzuki團(tuán)隊(duì)[11]的研究，CP能殺滅宿主大多數(shù)的T細(xì)胞。然而小部分T細(xì)胞存活并迅速增殖分化。這種T細(xì)胞能對CP產(chǎn)生抗性，并分化成記憶性的細(xì)胞。在異源物中可能存在不同的組織相容性抗原和不同數(shù)量的免疫細(xì)胞。所以，對這些細(xì)胞的清除是能否誘發(fā)移植物耐受的關(guān)鍵。研究發(fā)現(xiàn)，通過異基因移植聯(lián)合CP預(yù)處理，再進(jìn)行大量的異源脾細(xì)胞移植可以導(dǎo)致小鼠長期的免疫細(xì)胞分離。這種現(xiàn)象可以提高免疫耐受，并且顯著提高生存期[12]。

關(guān)于移植物抗腫瘤的機(jī)制目前還不是十分清楚，體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)移植的脾細(xì)胞含有大量CD4+T細(xì)胞、NK細(xì)胞和單核細(xì)胞，在這些細(xì)胞中，T細(xì)胞和NK細(xì)胞可能與抗腫瘤作用關(guān)系密切。然而，在移植物抗腫瘤的效應(yīng)中，T細(xì)胞存在著副作用[13]。因此，本實(shí)驗(yàn)為以后對T細(xì)胞作用以及GVT的機(jī)制研究打下了基礎(chǔ)。腫瘤的免疫耐受可能與腫瘤起源于自身正常組織相關(guān)。在腫瘤發(fā)病過程中，Ⅰ類主要組織相容性復(fù)合體(MHC)下調(diào)。因此，特異性的細(xì)胞毒性T細(xì)胞不能被激活。進(jìn)一步的研究表明對于異基因移植(DLI)的策略十分關(guān)鍵，一次性大劑量的植入會(huì)引起嚴(yán)重的GVHD反應(yīng)，而小劑量多次的植入被認(rèn)為能降低GVHD的效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)認(rèn)為應(yīng)首先考慮移植的時(shí)機(jī)，其次考慮移植的劑量。在CP和DLI聯(lián)合治療組中，輸注的BALB/C小鼠的脾細(xì)胞為1.0×107個(gè)/ml，分別于第3、14、21,28天。CP劑量為100 mg/kg。

DLI聯(lián)合CP處理可以誘發(fā)特異性的免疫耐受。本實(shí)驗(yàn)中預(yù)處理十分重要.。DLI和CP對CT26腫瘤的治療表現(xiàn)為協(xié)同的作用，腫瘤得到了明顯的抑制。并且存活期明顯延長。供體的脾細(xì)胞有潛在的抗腫瘤作用，移植的脾中含有大量的異源淋巴細(xì)胞和少量造血干細(xì)胞。此理論可能對實(shí)體瘤的治療大有裨益。然而本實(shí)驗(yàn)仍存在明顯不足，比如未能發(fā)現(xiàn)治療過程中腫瘤的病理學(xué)變化，對具體的機(jī)制認(rèn)識不清等。這也將是我們下一階段的工作方向。

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(編輯：吳小紅)

Study of Graft Versus Tumor Effect for Colorectal Cancer

ZHANGXiaochuan,TANGShuyao,LIJiyou,etal.

TheFirstAffiliatedHospitalofHarbinMedicalUniversity,Harbin,150000

Objective To build a comprehensive adjuvant therapy for colorectal cancer through graft versus tumor effect(GVT) and related cell factor.Methods Subcutaneous injection of CT26 tumor cells of BALB/C mice was conducted to establish the mouse model of colorectal cancer The mice model were randomized into different group and recorded survival times,tumor size and tumor growth inhibition rates.Results The group treated by DLI+ CP survived (34.9±2.75) days and the untreated group survived (15.4±2.50) days(P<0.01).The tumor inhibitory rate was 94.3% in DLI+CP group and CP or DLI alone group were 69.4% and 74.4%.Conclusion GVT effect is helpful for the treatment of tumor,it is a new method for the treatment of solid tumor cells in the future.

Graft versus tumor effect(GVT)；Colorectal cancer；Donor lymphocyte infusion(DLI)；Cyclophosphamide (cp)

蘇州市2015年度第九批產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新專項(xiàng)(編號：SYS201552)

150000 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院(張曉川，唐樹堯，李吉友，陳志男，侯利民)；215004 蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院(葉振宇)

侯利民

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.06.002

R735.3+4

A

1001-5930(2017)06-0875-04

2016-07-08

2017-03-21)