方雪松

[摘要] 目的 研究皮膚、肉芽組織采用石蠟切片以及冰凍切片免疫組化的染色效果。方法 2014年8月—2016年8月期間選取Wistar大鼠共60只，雙盲法隨機分為A、B兩組各30只。實驗前對60只大鼠進(jìn)行背部切割傷，脫毛后在每只大鼠背部切割傷部位取1 cm×1 cm大小的皮膚塊作為標(biāo)本，A組大鼠皮膚塊標(biāo)本采用石蠟制片，B組大鼠皮膚塊標(biāo)本采用冰凍制片。對兩組大鼠標(biāo)本切片進(jìn)行免疫組化染色，觀察兩組大鼠標(biāo)本切片染色情況。 結(jié)果 B組SP、EGF、EGFR以及FGF強陽性率分別為96.67%、100.00%、96.67%、93.33%，明顯高于A組的0.00%（P<0.05）。A1組抗原活性陽性率分別為93.33%、96.67%、93.33%、100.00%。明顯高于A2組的13.33%、13.33%、3.33%、6.67%以及A3組的10.00%、16.67%、13.33%、3.33%（P<0.05）。B1組EGF、FGF抗原活性強陽性率分別為100.00%、93.33%，高于B2組的6.67%、3.33%（P<0.05）。結(jié)論 冰凍制片免疫組化染色效果更佳，值得臨床應(yīng)用及推廣。

[關(guān)鍵詞] 皮膚；肉芽組織；冰凍制片；石蠟制片；免疫組化染色

[中圖分類號] R5 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-0742（2017）05（a）-0016-03

[Abstract] Objective To study the effects of paraffin sections and frozen sections on Immumohistochemical staining in the tissues of skin and granulation. Methods 60 Wistar rats were selected from August 2014 to August 2016 and randomly divided into group A and group B with 30 cases in each group respectively. Before experiment， 60 rats were concis on the back. After removing the hair， the skin with the size of 1 cm×1 cm was taken from cut injuries on the back and served as sample. The specimens of rats in group A were adopted paraffin sections， and rats in B group were adopted frozen sections. Immunohistochemical staining was performed on the two groups of rats to observe the section staining of the rats in two groups. Results The positive rates of SP， EGF， and EGFR in group B 96.67%、100.00%、96.67%、93.33% were significantly higher than those of group A 0.00%（P<0.05）. In group A， the weak positive rates were relatively higher with regard to antigen activity detection for specimens of A2 and A3（93.33%、96.67%、93.33%、100.00% vs 13.33%、13.33%、3.33%、6.67% vs 15.00%、16.67%、13.33%、3.33%）. However， the above mentioned antigen activity detection rates of A1 were significantly higher than those of A2 and A3 with（P<0.05）. In group B， the strong positive rates of B1 group with significantly higher than those of B2 with regard to antigen activity detection of EGF and FGF with（10.00%、93.33% vs 6.67%、3.33%）（P<0.05）. Conclusion The effect of frozen sections is significantly better than that of paraffin sections on immumohistochemical staining， which is worthy of clinical application and popularization.

[Key words] Skin； Granulation Tissue； Frozen Sections； Paraffin Sections； Immunohistochemical Staining

病理組織檢查在臨床上應(yīng)用廣泛，是眾多疾病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。臨床上常見的檢查手段包括組織石蠟制片檢測以及組織冰凍切片檢測，兩種方法的優(yōu)劣在臨床上眾說紛紜，褒貶不一，在臨床上也無相關(guān)的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，爭議性較大[1-2]。因此該文于2014年8月—2016年8月期間對60只大鼠模型進(jìn)行研究，探討皮膚和肉芽組織中石蠟切片和冰凍切片免疫組化染色效果的差異，為臨床病理組織診斷提供理論依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

該次選取由武漢大學(xué)動物研究所提供的Wistar大鼠60只進(jìn)行研究，所有大鼠均為雄性。大鼠體重270～320 g之間，平均體重（288.6±10.5）g。將所有大鼠按雙盲法分為兩組各30只。A組大鼠體重270～316 g，平均體重（288.4±10.2）g。B組大鼠體重270～320 g，平均體重（289.1±10.6）g。兩組大鼠上述資料（性別、體重）差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

1.2 方法

1.2.1 試劑與材料 采用Leica2235型石蠟切片機以及Leica1950型冰凍切片機，Olympus BX-50顯微鏡。

1.2.2 實驗前準(zhǔn)備 所有大鼠在實驗前1周進(jìn)行背部皮膚全層割傷，致傷前2 d采用10% Na2S進(jìn)行背部脫毛。

1.2.3 石蠟制片 致傷一周后將A組大鼠活殺，取背部皮膚新鮮肉芽組織為標(biāo)本，4%多聚甲醛固定24 h，之后石蠟包埋、切片，烤箱中常規(guī)脫蠟1 h。①蒸餾水配置3% H2O2溶液，將所得標(biāo)本切片放入H2O2中室溫下滅活5 min，使用蒸餾水沖洗3次，2 min/次。②洗滌后采用0.01 mol/L檸檬酸緩沖液浸泡標(biāo)本，加熱至100℃，時間30 min。冷卻后在37℃下加入0.1%胰蛋白酶10 min，蒸餾水再洗滌3次，2 min/次，下接免疫組化染色。該組標(biāo)本為A1組。③切片經(jīng)過步驟①處理后直接在37℃下加入0.1%胰蛋白酶10 min，蒸餾水洗滌3次，2 min/次，下接免疫組化染色。該組為A2組。④石蠟切片后直接與B1組行相同處理為A3組。

1.2.4 冰凍切片 致傷1周后將B組大鼠麻醉，4%多聚甲醛灌注固定，取出背部新鮮肉芽組織再行2 h固定，之后放入20%蔗糖溶液中過夜，溫度4℃，次日取出行冰凍切片，厚度為25 μm。實驗時采用純甲醇和H2O2配置為0.5%溶液，將切片浸泡溶液中30 min，蒸餾水洗滌3次，2 min/次，再將標(biāo)本浸泡至0.1% Triton中1 h，蒸餾水洗滌，2 min/次，洗滌兩次后接免疫組化染色。該組為B1組。冰凍切片經(jīng)處理后進(jìn)行加熱修復(fù)和酶消化，下接免疫組化染色。該組為B2組。

1.3 觀察指標(biāo)

觀察兩組切片標(biāo)本免疫組化陽性情況，對比相同切片經(jīng)熱修復(fù)、酶消化與未經(jīng)熱修復(fù)、酶消化的結(jié)果情況。陽性判斷結(jié)果分析，以DAB顯色最強處顏色程度為準(zhǔn)[3]，陰性（-）：完全不著色；弱陽性（+）：著色為淡棕色；陽性（++）：著色為棕色；強陽性（+++）：著色顏色極深。

1.4 統(tǒng)計方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析和處理數(shù)據(jù)，計量資料用（x±s）表示，采用t檢驗，計數(shù)資料用[n（%）]表示，采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

B組SP、EGF、EGFR以及FGF強陽性率明顯高于A組（P<0.05）。A組中A2、A3標(biāo)本抗原活性檢測弱陽性率較高且差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；而A1上述抗原活性陽性率明顯高于A2、A3（P<0.05）。B組中B1在EGF、FGF抗原活性檢測中強陽性率明顯高于B2（P<0.05）。見表1。

3 討論

病理組織診斷需要進(jìn)行組織切片，并經(jīng)過免疫組化染色過程分析，從而對病理情況進(jìn)行判斷。其中步驟復(fù)雜繁多，容易受到各種因素的影響[4]。

目前在臨床上認(rèn)為影響組織切片的因素包括[5]：①固定液的種類、溫度以及固定時間長短會影響組織抗原性，而固定劑在固定組織時是否形成醛鍵，導(dǎo)致組織蛋白與蛋白之間發(fā)生交聯(lián)，導(dǎo)致抗原決定簇被破壞，也是影響組織抗原性質(zhì)的重要因素，可能引起抗原在免疫組化染色中不能與抗原充分結(jié)合，導(dǎo)致染色效果不準(zhǔn)確。目前在組織免疫組化染色的過程中以盡可能縮短固定時間為原則，避免時間過長導(dǎo)致的影響[6]。研究顯示[7]，一般組織最佳固定時間在3～6 h，一般臨床上控制在12 h以內(nèi)。而動物實驗則表明[8-9]，采用原位灌注再浸泡固定的方法可取的滿意效果。②制片過程中的影響，包括脫水液的種類、溫度、時間以及ph值。在傳統(tǒng)的石蠟制片中，需要對組織進(jìn)行反復(fù)的二甲苯、酒精等溶劑浸泡處理，在制作切片過程中的高溫環(huán)境中容易對石蠟切片產(chǎn)生影響，從而對免疫組化染色結(jié)果造成一定影響。而冰凍切片技術(shù)則有效的避免了上述高溫、反復(fù)浸泡溶劑等影響，可有效提高免疫組化染色效果[10]。在該文中采用大鼠背部皮膚肉芽組織進(jìn)行研究，分別使用石蠟制片和冰凍切片，并詳細(xì)分為酶消化、熱修復(fù)等處理，結(jié)果顯示，B組SP、EGF、EGFR以及FGF強陽性率分別為96.67%、100.00%、96.67%、93.33%，明顯高于A組的0.00%（P<0.05）。A1組抗原活性陽性率分別為93.33%、96.67%、93.33%、100.00%。明顯高于A2組的13.33%、13.33%、3.33%、6.67%以及A3組的10.00%、16.67%、13.33%、3.33%（P<0.05）。B1組EGF、FGF抗原活性強陽性率分別為100.00%、93.33%，高于B2組的6.67%、3.33%（P<0.05）。結(jié)果提示采用冰凍制片有效提高了免疫組化染色準(zhǔn)確率。而在其他學(xué)者的研究中也顯示[11]，采用冰凍切片進(jìn)行免疫組化染色陽性率高達(dá)95.00%以上，而石蠟切片免疫組化染色陽性率僅為80.00%，提示冰凍切片組化免疫效果更高，該文結(jié)果與之相符。

綜上所述，冰凍制片免疫組化染色效果更佳，值得臨床應(yīng)用及推廣。

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（收稿日期：2017-02-05）