嚴(yán)紅梅+阮琰+林偉+唐偉偉+熊麗君+黃明翔+翁麗珍

[摘要] 目的 用表面增強激光解析電離飛行時間質(zhì)譜（SELDI-TOF-MS）技術(shù)和蛋白質(zhì)芯片技術(shù)檢測兒童支原體肺炎（MPP）和非MPP患者血清蛋白指紋圖譜，探討基于人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的的蛋白指紋圖譜診斷模型對兒童MPP早期診斷的價值。方法 用SELDI-TOF-MS技術(shù)和蛋白質(zhì)芯片技術(shù)測定2014年11月—2016年6月該院兒科住院的130例血清標(biāo)本的蛋白指紋圖譜，其中MPP 68例，非MPP 62例。將測定的血清蛋白指紋圖譜建立人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測模型，用隨機抽取的75例標(biāo)本（MPP 40例，非MPP 35例）作為訓(xùn)練組，進行訓(xùn)練與交叉驗證，另外55例標(biāo)本（MPP 28例，非MPP 27例）作為測試組，進行盲法驗證該模型。結(jié)果 利用從75例訓(xùn)練組得出的基于人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的由M/Z為4 094.91、4 650.51、5 825.38、6 031.77、7 862.79、10 122.04組成的MPP血清蛋白指紋圖譜決策樹診斷模型，對MPP診斷的敏感性95.00%（38/40），特異性為88.57%（31/35），陽性率為92.00%（69/75），ROC曲線下面積為0.975，利用測試組的55例標(biāo)本對模型進行驗證，結(jié)果顯示，對MPP診斷的敏感性89.29%（25/28），特異性為96.30%（26/27），陽性率為92.27%（51/55）。結(jié)論 該研究建立的支原體肺炎蛋白指紋圖譜診斷模型對支原體肺炎的檢測時間短，診斷準(zhǔn)確率高，有助于診斷支原體肺炎。

[關(guān)鍵詞] 蛋白指紋圖譜技術(shù)；實驗室診斷技術(shù)；兒童支原體肺炎

[中圖分類號] R5 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-0742（2017）05（a）-0004-05

[Abstract] Objective Enhanced laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry（SELDI-TOF-MS） with the purpose of detecting mycoplasma pneumonia in children and the technology of protein chip technology（MPP） and non MPP serum protein fingerprint， explore the early diagnosis of children MPP protein fingerprints of the artificial neural network diagnostic model based on the value of. Methods The protein fingerprints of 130 serum samples which be in pediatrics from Nov. 2014 to Jun. 2016 were determined by SELDI-TOF-MS and protein chip technique， including MPP 68 cases and non MPP 62 cases. The determination of serum protein fingerprint to establish artificial neural network prediction model， using 75 samples randomly selected （MPP 40 cases， MPP 35 cases） as the training group， training and cross validation， the other 55 specimens （MPP 28 cases， MPP 27 cases） as the test group， the blind method to verify the model. Results From 75 cases of training group based on the artificial neural network by M/Z was 4 094.91， 4 650.51， 5 825.38， 6 031.77， 7 862.79， 10 122.04 OMPP serum protein fingerprint decision tree diagnosis model， the sensitivity of 95.00% in diagnosis of MPP （38/40）， the specificity was 88.57% （31 /35）， the positive rate was 92.00% （69/75）， the area under the ROC curve was 0.975， verified the model by using 55 samples test Results showed that the sensitivity of 89.29% in diagnosis of MPP（25/28）， the specificity was 96.30% （26/27）， the positive rate was 92.27% （51/55）. Conclusion The diagnostic model of Mycoplasma pneumoniae protein fingerprint established in this study can be used for the diagnosis of Mycoplasma pneumonia.

[Key words] Protein fingerprinting technology； Laboratory diagnosis； Mycoplasma pneumonia in children

有研究顯示病原體為肺炎支原體（Mycoplasma，MP）的支原體肺炎（Mycoplasma pneumoniae pneumonia，MPP），在因社區(qū)獲得性肺炎（Community acquired pneumonia，CAP）住院的兒童患者中所占比例可達(dá)10%～40%[1-2]。傳統(tǒng)認(rèn)為MPP大多數(shù)臨床癥狀相對較輕，經(jīng)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素治療后癥狀可好轉(zhuǎn)，且支原體感染多有自限性，預(yù)后良好。但是近幾年，臨床表現(xiàn)為難治性支原體肺炎（RMPP）及重癥支原體肺炎（SMPP）的患者逐漸增多[3]。重癥支原體肺炎（SMPP）容易出現(xiàn)胸腔積液、肺不張、壞死性肺炎、肺膿腫等嚴(yán)重并發(fā)癥以及引起皮膚黏膜、泌尿系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)等功能的損害[4-5]，進而危及生命。目前臨床最常應(yīng)用的診斷肺炎支原體（MP）感染的檢驗方法為血清支原體特異性抗體檢測，但是抗體在疾病發(fā)病早期的血清學(xué)檢查結(jié)果可為陰性，而且在嬰幼兒及免疫低下者，由于產(chǎn)生抗體的免疫應(yīng)答反應(yīng)相對低下，早期抗體滴度不高，均較容易出現(xiàn)漏診。近年來，蛋白指紋圖譜技術(shù)（protein fingerprinting technolo-gy，PFP）、表面增強激光解析電離飛行時間質(zhì)譜（SELDI-TOF-MS）技術(shù)和蛋白質(zhì)芯片技術(shù)已廣泛應(yīng)用于惡性腫瘤、肺結(jié)核、SARS、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病的診斷，關(guān)于PFP應(yīng)用于兒童MPP的研究國內(nèi)鮮見報告。該研究方便選擇2014年11月—2016年6月在該院兒科住院的兒童MPP、非MPP共130例患兒進行血清蛋白指紋圖譜檢測，尋找支原體肺炎的特異蛋白峰，建立兒童支原體肺炎的蛋白指紋圖譜庫，以提高支原體肺炎的早期診斷從而給予及時準(zhǔn)確的治療，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

方便選擇在該院兒科住院的肺炎患者130例，其中MPP患兒68例，非MPP患兒62例為研究對象。兩組患兒均無其他呼吸道及肺部疾病。68例MPP，男32例，女36例，年齡1～14歲，平均（5.95±3.07）歲，病程3～180 d，平均（17.99±32.84）d，62例非MPP患兒，男35例，女27例，年齡7月～12歲，平均（5.25±2.97）歲，病程2～60 d，平均（14.85±15.29）d。兩組患者的年齡、性別構(gòu)成比、病程等一般資料具有可比性（P>0.05）。各組臨床癥狀如表1。所有病例隨機分成兩組：訓(xùn)練組75例（MPP 40例，非MPP 35例），測試組55例（MPP 28例，非MPP 27例）。MPP組中，臨床癥狀分別為67例咳嗽，54例（79.41%）發(fā)熱，15例（22.06%）氣喘，3例（4.41%）胸痛，1例咯血，非MPP組中，62例（100.00%）咳嗽，41例（66.13%）發(fā)熱，27例（43.55%）氣喘。排除標(biāo)準(zhǔn)：排除內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病患者，肝、腎、心功能不全患者，精神病史者，先天畸形患者。診斷標(biāo)準(zhǔn)：兒童肺炎及支原體肺炎診斷標(biāo)準(zhǔn)均參照第七版實用兒科學(xué)中兒童肺炎及支原體肺炎診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]。

1.2 檢測方法

1.2.1 主要儀器和試劑 型號為PBSⅡ/C的蛋白指紋圖譜儀，弱陽離子交換型蛋白磁珠（WCX Magnetic Beads）。

1.2.2 血清標(biāo)本的收集 患兒入院第2天清晨空腹抽取靜脈全血2 mL，放于4℃冰箱中靜置1～2 h，然后離心10 min（4℃，3 000 r/min），取出上層血清分裝，保存于-80℃的冰箱。

1.2.3 檢測步驟 ①血清樣品的處理：取5 μL血清樣品加入10 μL裂解液，室溫下混合孵育30 min，加入185 μL PH為7.4的磷酸鹽緩沖液稀釋。②取50 μL的磁珠加入200 μL PCR Tube中，于室溫下磁鐵上孵育1 min，去除上清液；PCR Tube加入50 μL緩沖液洗脫5 min后，磁鐵上孵育1 min后，去除上清液；PCR Tube再次加入100 μL緩沖液洗脫5 min，PCR Tube磁鐵上孵育1 min，然后把PCR Tube加入100 μL血清樣品（處理好的）。（3）加入血清樣品的PCR Tube孵育30 min（室溫），PCR Tube在室溫下于磁鐵上孵育1 min，去除上清液，PCR Tube加入100 μL緩沖液洗脫5 min；PCR Tube磁鐵上孵育1 min，去除上清液，PCR Tube加入10 μL洗脫緩沖液洗脫5 min；PCR Tube磁鐵上孵育1 min，取出上清液5 μL移至另一PCR Tube中，PCR Tube加入5 μL SPA（人葡萄球菌蛋白A）飽和溶液充分混勻，取1 μL混合溶液加樣到全鋼（Au/PCR TubeSteel）芯片上風(fēng)干。

1.2.4 數(shù)據(jù)收集 芯片干燥以后，放入型號為PBSⅡ/C的質(zhì)譜儀收集數(shù)據(jù)，用Proteinchip Sohware 3.2.1軟件采集血清蛋白質(zhì)譜表達(dá)譜。

1.3 肺炎支原體抗體檢測

所有患兒入院第2天清晨空腹抽取靜脈血2 mL，使用免疫熒光法檢測肺炎支原體IgM，使用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA法）檢測肺炎支原體IgM及IgG的混合抗體，對肺炎支原體混合抗體為1：40或1：80的患兒1周后再次抽取靜脈血檢測抗體滴度。

1.4 統(tǒng)計方法

用BiomarkerWizard軟件提取信噪比>5的蛋白峰做后續(xù)統(tǒng)計分析變量，用SPSS 16.0統(tǒng)計學(xué)軟件對兩組組計量數(shù)據(jù)進行獨立樣本t檢驗，用BPS 5.0軟件對獨立樣本t檢驗分析結(jié)果P<0.01的蛋白峰建立診斷決策模型，并進行驗證。用R0C曲線下面積評價診斷模型的正確性。

2 結(jié)果

2.1 支原體肺炎蛋白指紋圖譜診斷模型的建立

對所有數(shù)據(jù)進行分析，發(fā)現(xiàn)P<0.01的蛋白峰共有33個，然后通過人工智能神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)軟件自主挑選出6個蛋白峰見表1，M/Z分別為4 094.91、4 650.51的2個蛋白峰在MPP組中高表達(dá)，M/Z分別為5 825.38、6 031.77、7 862.79、10 122.04的4個蛋白峰在MPP組中低表達(dá)。建立由這6個蛋白峰組成的決策樹診斷模型，見圖1。該診斷模型規(guī)則為當(dāng)?shù)鞍追宸弦韵聴l件之一則為非MPP：①M4 650.51≤3.205 53且M4 094.91≤4.150 69，②M4 650.51>3.205 53且M6 031.77≤0.181 587且M7 862.79≤2.560 78且M5 825.38>1.810 7，③M4 650.1>3.205 53且M6 031.77>0.181 587且M6 031.77≤2.164 23且M10 122.00≤0.296 411且M7 862.79>1.840 15，④M4 650.51>3.205 53且M6 031.77>2.164 23，當(dāng)?shù)鞍追宸弦韵聴l件之一則為MPP：①M4 650.51≤3.205 53且M4 094.91>4.150 69，②M4 650.51>3.205 53且M6 031.77≤0.1815 87且M7 862.79≤2.560 78 M5 825.38≤1.810 7，③M4 650.51>3.205 53且M6 031.77≤0.1815 87且M7 862.79>2.560 78，④M4 650.51>3.20 553且M6 031.77>0.181 587且M6 031.77≤2.164 23且M10 122.0≤0.296 411且M7 862.79≤1.840 15，⑤M4 650.51>3.205 53且M6 031.77>0.181 587且M6 031.77≤2.164 23且M10 122.0>0.296 411。用此模型診斷35例非MPP，31例正確，4例錯誤；診斷40例MPP，38例正確，2例錯誤，見表2。此診斷模型診斷支原體肺炎的敏感性95.00%（38/40），特異性為88.57%（31/35），陽性率為92.00%（69/75）。此決策樹模型診斷非支原體肺炎的ROC值曲線下面積達(dá)0.975，見圖2，診斷支原體肺炎ROC曲線下面積為0.975，見圖3。M/Z為4650.51、7862.79的蛋白峰表達(dá)差異在MPP組和非MPP組的比較見圖4。

2.2 支原體肺炎蛋白指紋圖譜診斷模型的盲法驗證

將測試組55例標(biāo)本的血清蛋白質(zhì)譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入已建立的決策樹診斷模型，其中非MPP 27例，MPP 28例。結(jié)果顯示，27例非MPP樣本中，26例診斷正確，1例診斷錯誤，28例MPP中，25例診斷正確，3例診斷錯誤，見表3。診斷模型的檢測MPP的敏感性89.29%（25/28），特異性為96.30%（26/27），陽性率為92.27%（51/55）。盲法驗證支原體肺炎的診斷模型，進一步分析驗證了所建立模型的準(zhǔn)確性及有效性。

3 討論

兒童MPP臨床表現(xiàn)輕重不一，病程長、病情復(fù)雜，大約1/4患兒可出現(xiàn)呼吸系統(tǒng)以外的并發(fā)癥，重者可表現(xiàn)為壞死性肺炎、肺膿腫、Stevens-Johnson綜合征、心肌損害、腦膜炎、嗜血細(xì)胞綜合征、肝功能損害，甚至有危及生命的風(fēng)險[7-8]。因此，尋找一種簡便、快速的支原體肺炎的診斷標(biāo)志物，有著重要的臨床意義。

人類基因組測序計劃的完成，使得疾病的診斷可以通過對蛋白質(zhì)的分析來完成。血液中可檢測到的蛋白質(zhì)>2 000種，通過對其進行分析，可反映出不同疾病不同階段的病理改變[9-10]。蛋白指紋圖譜技術(shù)（PFP），是通過蛋白指紋圖譜儀利用激光脈沖輻射使芯池中的樣品分子電離，檢測不同的離子在電場中飛行的時間，從而可以測定離子的荷質(zhì)比（M/Z），進而形成質(zhì)譜。通過對圖譜進行分析，可發(fā)現(xiàn)新的與各種疾病相關(guān)的特異性蛋白質(zhì)。

隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展和應(yīng)用，病原體的研究從基因轉(zhuǎn)向了蛋白質(zhì)組學(xué)，已有報道進行相關(guān)研究的病原體有病毒、細(xì)菌、結(jié)核菌。王雅杰等[11]報道，應(yīng)用PFP技術(shù)建立的SARS診斷模型，敏感性為97.30%，特異性為91.80%。黃文芳等[12]報道在分子量5～20 KD范圍內(nèi)不同種引起血流感染的細(xì)菌具有特征性蛋白指紋圖譜，同種引起血流感染的細(xì)菌則具有相似的蛋白指紋圖譜，主要蛋白峰分子量的變異系數(shù)小于0.1%。曾白華等[13]報道應(yīng)用SELDI-TOF-MS技術(shù)建立的產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌蛋白質(zhì)譜決策樹診斷模型，靈敏度和特異度分別為93.33%、96.43%。王琳等[14]進行的研究顯示，利用蛋白指紋圖譜技術(shù)建立的診斷模型，診斷菌陰肺結(jié)核與肺炎的總有效率為84.20%，靈敏度為82.50%，特異度為85.90%。翁麗珍等[15]報道應(yīng)用蛋白指紋圖譜技術(shù)建立的診斷模型，診斷社區(qū)獲得性細(xì)菌性肺炎的敏感度為100.00%，特異度92.30%，陽性率為95.80%。該研究建立的診斷模型診斷MPP的敏感性95.00%，特異性為88.57%，陽性率為92.00%，靈敏度及特異度均較高。

該研究對130例兒童肺炎患者進行支原體抗體檢測，其中有59例在入院第2天抽血結(jié)果中顯示肺炎支原體IgM陽性或IgM及IgG混合抗體濃度≥1：160，9例在入院1周后抗體濃度呈4倍升高從而診斷MPP，對所有兒童肺炎患兒檢測血清蛋白指紋圖譜，并進行分析，發(fā)現(xiàn)有差異的蛋白峰共有33個，通過人工智能神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)軟件自主挑選出6個蛋白峰，M/Z為4 094.91、4 650.51的2個蛋白峰在支原體肺炎中高表達(dá)，M/Z為5 825.38、6 031.77、7 862.79、10 122.04的4個蛋白峰在支原體肺炎組中低表達(dá)。用這6個蛋白峰建立的診斷模型MPP診斷的敏感性95.00%，特異性為88.57%，陽性率為92.00%，ROC曲線下面積為0.975，且蛋白指紋圖譜檢測可在1 h內(nèi)完成。為MPP的早期診斷提供快速、靈敏度及特異性均高的診斷依據(jù)，同時為建立兒童MPP人群的蛋白質(zhì)組學(xué)譜庫提供重要資料。

該研究檢測出有差異的蛋白峰共有33個，由于未設(shè)置健康兒童對照組，不能保證它們都是MPP與非MPP患者之間的差異蛋白，該研究進一步增加病例數(shù)，并設(shè)置健康兒童對照組，根據(jù)病原學(xué)進行分析，監(jiān)測同一患者在不同時期蛋白指紋圖譜的變化，將對蛋白指紋圖譜技術(shù)在兒童MPP早期診斷的應(yīng)用價值提供臨床依據(jù)。

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（收稿日期：2017-02-10）