辛宇 Melia BogariZin Mar Aung 陳偉 柴崗 張艷

·基礎研究·

CD26分子在正常皮膚組織和瘢痕疙瘩組織中成纖維細胞表達的差異分析

辛宇 Melia BogariZin Mar Aung 陳偉 柴崗 張艷

目的 探究CD26表面分子在正常皮膚組織和瘢痕疙瘩成纖維細胞中表達的差異。方法 正常皮膚成纖維細胞（NFs）組的正常皮膚組織取自接受腹部整形術的10例患者；瘢痕疙瘩成纖維細胞（KFs）組瘢痕疙瘩組織取自此前未經過任何治療的10例瘢痕疙瘩患者的胸部和腹部。利用酶消化法獲得原代KFs和NFs，應用流式分析技術檢測CD26表面分子在2組細胞中的表達差異。用流式分選技術對NFs和KFs組中CD26表達陽性（CD26+）與表達陰性（CD26-）細胞進行分選，體外常規(guī)培養(yǎng)4 d后對細胞形態(tài)進行初步分析。結果 CD26表面分子在KFs和NFs中均可表達，但KFs組表達率（46.65±13.97）%明顯高于NFs組（24.75±16.85）%，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。經流式分選后，CD26+與CD26-細胞群在NFs與KFs組中形態(tài)均無明顯差異。結論 CD26分子在瘢痕疙瘩組織成纖維細胞中的表達率明顯高于正常皮膚組織成纖維細胞中的表達率，CD26-和CK26+細胞群在形態(tài)上無明顯差異。

CD26分子；成纖維細胞；瘢痕疙瘩；正常皮膚；流式細胞術

目前，瘢痕疙瘩治療中的高復發(fā)率和治療的復雜性仍是臨床面對的棘手問題[1-3]。盡管瘢痕疙瘩的發(fā)病機制尚不清楚，大多數病因理論認為其與成纖維細胞功能障礙相關[4]。因此，將治療方向轉向細胞學水平有可能為臨床治療帶來全新的視角，并且為進一步深入分析疾病分子學病理機制奠定基礎。自2016年1～7月，上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院整復外科以流式分析技術為基礎，研究CD26分子在瘢痕疙瘩中成纖維細胞的表達情況，為進一步的功能學研究做好基礎，并為在細胞學水平治療瘢痕疙瘩疾病提供新思路。

1 對象和方法

1.1 實驗主要試劑和儀器

0.2 %復合膠原酶NB4（SERVA Electrophoresis-GmbH，德國）；0.2%中性蛋白酶（Roche，德國）；磷酸鹽緩沖液、0.25%胰蛋白酶（上海思吉生物制品有限公司）；胎牛血清（FBSGibco，美國）；DMEM高糖培養(yǎng)液（Gibco，美國）；FITC anti-human CD26（BioLegend，美國）。

FACSCalibur流式細胞儀（BD，美國），恒溫CO2培養(yǎng)箱（Forma Scientific，美國）；普通臺式離心（Heraeus，美國）；倒置相差顯微鏡（Olympus，日本）；超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）；10 cm培養(yǎng)皿、50 ml離心管、15 ml離心管、200目尼龍濾網（Falcon，美國）。

1.2 方法

1.2.1 標本取材及實驗分組 正常皮膚成纖維細胞（normal skin fibroblasts,NFs）組正常皮膚組織取自接受腹部整形術且無瘢痕疙瘩病史和家族史的10例患者，其中男性3例，女性7例；年齡30～50歲。瘢痕疙瘩成纖維細胞（keloid fibroblasts,KFs）組10例瘢痕疙瘩組織取自瘢痕疙瘩切除術獲得的胸部和腹部瘢痕疙瘩組織，其中男性4例，女性6例；年齡25～45歲。本實驗經過上海市第九人民醫(yī)院倫理委員會批準，NFs組和KFs組中所有患者在試驗前均簽署了知情同意書。

1.2.2 KFs組入選及排除標準 KFs組入選標準：⑴符合瘢痕疙瘩疾病的臨床診斷標準。①病損范圍超過原病灶范圍；②病變組織質硬、發(fā)紅，表面光滑且高于正常皮膚組織；③存在痛、癢等刺激癥狀。⑵年齡為18～65歲，性別不限。⑶病變發(fā)生部位為軀干。⑷病程小于2年，尚處于疾病急性期。⑸患者充分理解并且簽署知情同意書。KFs組排除標準：⑴之前接受過任何形式的瘢痕疙瘩治療。⑵病灶區(qū)內有潰瘍現象。

1.2.3 細胞獲取方法 瘢痕疙瘩標本以氯霉素沖洗液沖洗3遍，PBS充分振蕩洗滌3遍，去除血漬及其他組織碎片；無菌條件下去除表皮及皮下脂肪組織，將獲得的瘢痕疙瘩真皮部分剪至2 mm×2 mm，PBS振蕩洗滌1遍，用0.2%復合膠原酶NB4以37℃恒溫振蕩消化，5～8 h收獲真皮層細胞。消化產物以200目尼龍篩過濾，細胞懸液以1500 r/min離心5 min，棄去上清液。加入PBS振蕩混勻，1500 r/min離心5 min，棄去上清液，接種于含10%FBS的DMEM的培養(yǎng)皿，并置于37℃恒溫混合氣體（5%CO2和95%O2）環(huán)境中進行原代培養(yǎng)，每隔3 d換液1次。

正常皮膚組織標本以氯霉素沖洗液沖洗3遍，PBS充分振蕩洗滌3遍，去除血漬及其他組織碎片；無菌條件下去除皮下組織，并剪至2 mm×3 mm組織塊，PBS振蕩洗滌1遍；加入0.2%中性蛋白酶4℃消化過夜，PBS清洗、終止消化，并輕輕揭去表皮層。余下的真皮組織用無菌剪刀剪成l mm×l mm組織塊，用0.2%復合膠原酶NB4以37℃恒溫振蕩消化，4～6 h收獲真皮層細胞。消化產物以200目尼龍篩過濾，細胞懸液1500 r/min離心5 min，棄上清。加入PBS振蕩混勻，1500 r/min離心5 min，棄上清，接種于含10%FBS的DMEM培養(yǎng)皿，并置于37℃恒溫混合氣體（5%CO2，和95%O2）環(huán)境中進行原代培養(yǎng)，每隔3 d換液1次。

1.2.4 流式分析 原代成纖維細胞生長至80%融合度時，用0.25%胰蛋白酶消化，離心，重懸濃度為1×104/μl的細胞懸液。10μl抗人CD26試劑加入到100μl細胞懸液中，充分混勻，室溫下避光孵育20～30 min，同時在NFs和KFs組內分別設置陰性對照組，除不加10μl抗人CD26試劑外，均與組內實驗組經過相同處理。隨后樣本經流式分析儀在488 nm激光下檢測綠色熒光發(fā)射。經流式分選后NFs和KFs組細胞均可分為CD26表達陰性（CD26-）和CD26表達陽性（CD26+）細胞群。

1.2.5 細胞形態(tài)學觀察 分選后將兩組CD26-/+細胞接種于含10%FBS的DMEM培養(yǎng)皿，并置于37℃恒溫混合氣體（5%CO2，和 95%O2）環(huán)境中進行連續(xù)培養(yǎng)，4 d后在倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)和密度，比較兩組細胞差異。

1.2.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 10.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量數據以±s表示，組間比較采用非配對t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 CD26表達率流式分析結果

在NFs和KFs組內的陰性對照組中，細胞陰性率均大于98%，證明在無CD26抗體孵育時細胞基本無熒光表達。CD26在NFs組中表達率為（24.75±16.85）%，在 KFs組中表達率為（46.65±13.97）%，兩組差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見圖1。

2.2 細胞形態(tài)學分析

兩組中CD26-和CD26+成纖維細胞均呈現成纖維細胞的紡錘形，細胞大小及密度均勻，在細胞形態(tài)和細胞密度上基本一致，未呈現明顯差異（圖2）。

3 討論

成纖維細胞作為皮膚組織中支撐結構和分泌基質的主要功能細胞，長期以來被視為單一的功能細胞群體，而其多樣性研究鮮有報道。近年來，已有實驗利用移植和系譜示蹤技術證明，真皮組織中的成纖維細胞是分別來自于上、下真皮層的兩個功能不同的細胞系。在正常生理狀態(tài)下，包含有真皮乳頭層的上層真皮層細胞系成纖維細胞可以調節(jié)毛發(fā)生長和立毛肌功能，而包含有網織層真皮成纖維細胞的下層真皮層細胞則合成大量的細胞外基質和脂肪細胞前體細胞以及真皮脂肪細胞[5]。在皮膚損傷過程中，兩種來源細胞也不相同，在損傷修復的最初階段，是由下層真皮成纖維細胞發(fā)動，當進入上皮再生階段，上層成纖維細胞才會參與修復過程。Rinkevich等[6]利用非選擇性損耗的熒光活性細胞分類方法在小鼠動物模型中分選出了胚胎期表達基因Engrailed-1（En1）成纖維細胞系，證明了該細胞系在正常組織細胞外基質的分泌以及在創(chuàng)傷、放射和癌癥模型的纖維化相關過程中均起主要作用。最后，利用表面分子篩查技術，最終確定了CD26分子可作為區(qū)分En1+和En1-細胞系的表面標記物。CD26分子作為一種廣譜表達在哺乳動物細胞表面的二肽酶，在免疫系統(tǒng)激活和調節(jié)機制中起到重要作用，在多種皮膚相關疾病中也被證實有CD26 分子上調[7]。

圖1 NFs和KFs組CD26分子表達率流式分析結果（B3代表CD26-細胞，B4代表CD26+細胞，因本實驗加入的是單標抗體，故B1，B2無實際意義） a.NFs組陰性對照 b.NFs組加入抗人CD26試劑 c.KFs組陰性對照 d.KFs組加入抗人CD26試劑

圖2 NFs和KFs組CD26-/+成纖維細胞體外培養(yǎng)4 d后形態(tài)學觀察 a.NFs組CD26-（×40） b.NFs組CD26+（×40） c.KFs組 CD26-（×40） d.KFs組 CD26+（×40） e.NFs組 CD26-（×100） f.NFs組 CD26+（×100） g.KFs組 CD26-（×100） h.KFs組 CD26+（×100）

CD26是一種在大多數哺乳動物細胞中表達的Ⅱ型跨膜糖蛋白，可以從多肽或蛋白N端釋放二肽，在人體中可以表達在多種細胞表面，包括上皮細胞、成纖維細胞、內皮細胞以及激活的免疫細胞表面[8]。CD26主要與免疫系統(tǒng)的調節(jié)機制相關。此外，免疫系統(tǒng)中T細胞、B細胞、NK細胞和單核細胞都有其表達，該分子也是免疫系統(tǒng)相關細胞激活的表面標志物。CD26在免疫系統(tǒng)調控細胞分化和增殖方面起到關鍵作用[9-10]。在皮膚組織中，CD26在人體不同起源的角質細胞中對于DNA合成以及細胞增殖起到了極為重要的作用，此外，其還可以結合纖連蛋白在調節(jié)細胞與細胞外基質間相互作用發(fā)揮重要作用[11]，在一些損傷誘發(fā)的皮膚腫瘤和疾病中，其表皮細胞和真皮細胞都存在有明顯的CD26分子的上調[7,12]。

瘢痕疙瘩由于僅發(fā)生于人體，至今尚無理想的動物疾病模型，而目前關于該疾病的病理學機制仍存在爭議，因此，從細胞學水平探究疾病發(fā)生機制，并且直接以細胞為功能單位尋找治療方案，可能為瘢痕疙瘩臨床治療帶來全新的視角。同時，瘢痕疙瘩作為一種良性皮膚疾病，其特殊侵襲性與惡性腫瘤疾病有相似表現，已有相關研究證實該疾病與免疫機制失調有關[13]，而CD26分子表達與腫瘤細胞的侵襲力增加有關[14-16]。在瘢痕疙瘩中成纖維細胞作為主要的免疫應答細胞，其侵襲力也高于一般的成纖維細胞[2]。

據此我們推測，在瘢痕疙瘩中的成纖維細胞，其功能異常表現可能與CD26分子表達有關。本研究中以正常皮膚的成纖維細胞作為NFs組，以瘢痕疙瘩組織中的成纖維細胞作為KFs組，初步探索了CD26在2組細胞中表達的差異，而在KFs組中的CD26低表達也指示瘢痕疙瘩組織CD26+細胞群在功能上與細胞的高侵襲性有關。進一步實驗中，本課題組將繼續(xù)探索CD26+細胞群在該疾病纖維化相關功能以及細胞侵襲能力中的作用，并且希望通過應用CD26分子特異性抑制劑對細胞功能起到抑制作用。若能在細胞學水平證實CD26+成纖維細胞系在瘢痕疙瘩疾病中的作用及其機制，將有助于進一步解釋該疾病的發(fā)病機制，并且為疾病的臨床治療奠定基礎。

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Analysis of expression of the CD26 marker on keloid fibroblasts

XIN Yu,Melia Bogari,Zin Mar Aung,CHEN Wei,CHAI Gang,ZHANG Yan.(Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People′s Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China)

ObjectiveTo analyze the expression of the CD26 marker on normal skin fibroblasts(NFs)and keloid fibroblasts(KFs).MethodsNormal skin tissues in the NFs group were obtained from individuals who underwent abdominal plastic resection.Keloid tissues in the breast and abdomen were harvested in surgery from patients who did not receive any treatment for their keloids.Then NFs and KFs were obtained through the enzyme digestion method.Flow cytometry technology was used to analyze the expression of the CD26 marker on NFs and KFs,and isolate the CD26 positive expressed (CD26+)and CD26 negative expressed(CD26-)cell population of NFs and KFs.Then the cell morphology of CD26-/+fibroblasts were observed after 4 days in vitro culture by inverted microscope.ResultsThe CD26 marker was expressed in both KFs and NFs.KFs exhibited a higher expression rate of CD26(46.65±13.97)%than NFs with that of(24.75±16.85)%(P＜0.01).Observation of cell morphology after 4 days in vitro culture exhibited similar shape and cell density between CD26-cell population and CD26+cell population in both the NFs and KFs groups.ConclusionKFs exhibited a higher expression rate of CD26 than NFs,while the CD26-and CD26+cell population in both the NFs and KFs groups showed similar morphological characteristics.

CD26 marker;Fibroblasts;Keloid;Normal skin;Flowcytometrytechnology

CHAI Gang,Email:13918218178@163.com;ZHANG Yan,Email:13651817522@163.com

2016-11-30）

10.3969/j.issn.1673-7040.2017.01.011.

10.3969/j.issn.1673-7040.2017.01.011

國家自然科學基金面上項目（81372097）；上海市科學技術委員會科研計劃項目（14441900800，14441900802）；上海交通大學“醫(yī)工交叉研究基金”（YG2014MS06）；上海交通大學醫(yī)學院高峰高原計劃研究型醫(yī)師（20161420）

上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院 整復外科，上海200011

柴崗，Email:13918218178@163.com；

張艷，Email:13651817522@163.com

本文引用格式：辛宇,Bogari M,AungZM,等.CD26分子在正常皮膚組織和瘢痕疙瘩組織中成纖維細胞表達的差異分析[J].中國美容整形外科雜志,2017,28(1):39-42.