劉鋒 王娜 石恒 王志軍

離心法與過濾吸附法處理脂肪組織對(duì)脂肪細(xì)胞活性影響的比較

劉鋒 王娜 石恒 王志軍

目的 比較低速離心法（800 r/min）與過濾吸附法處理脂肪組織對(duì)移植脂肪細(xì)胞活性的影響。方法 從16例健康女性腹部或大腿部獲取脂肪后，對(duì)脂肪組織分別進(jìn)行離心（離心組）和過濾吸附（過濾吸附組）處理，應(yīng)用葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)法和錐蟲藍(lán)染色法檢測細(xì)胞活性，并行常規(guī)HE染色觀察脂肪細(xì)胞組織學(xué)變化。結(jié)果 過濾吸附組和離心組葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)量分別為（2.00±0.36）mmol/L和（1.50±0.25）mmol/L，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。過濾吸附組和離心組脂肪細(xì)胞存活率分別為（91.0±3.0）%和（85.5±3.2）%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.417）。組織學(xué)觀察顯示離心組有少量脂肪細(xì)胞存在損傷，細(xì)胞膜破裂不完整；過濾吸附組脂肪細(xì)胞分布均勻，形態(tài)保持完整，基本沒有損傷。結(jié)論 過濾吸附法處理脂肪顆粒與離心法相比，脂肪細(xì)胞活性較高，是一種有效且可行的脂肪處理方法。

自體脂肪移植；離心法；過濾吸附法；細(xì)胞活性；脂肪純化

自體脂肪因容易獲取、低致敏原性、可多次取材且價(jià)格相對(duì)低廉，被認(rèn)為是一種較理想的填充劑[1-4]。在脂肪的處理方法上，最常用的是離心法與過濾吸附法[5]，以往對(duì)離心法與過濾吸附法的比較研究中，均對(duì)采用高速離心法（1500或3000 r/min）與過濾吸附法處理脂肪組織后脂肪細(xì)胞的活性進(jìn)行比較[6-7]，而且離心速率越高對(duì)脂肪活性影響越大[8]。自2015年1～12月，我們比較了低速離心法（800 r/min）與過濾吸附法對(duì)脂肪顆粒細(xì)胞活性的影響。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

脂肪取自16例健康女性；年齡26～56歲，平均35.5歲；體質(zhì)量指數(shù)（BMI）為19.0～24.6，平均21.8。均為至成都米蘭柏羽美容醫(yī)院要求行腹部吸脂減肥或面部填充的患者。所有患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 脂肪的獲取 術(shù)前標(biāo)記吸脂區(qū)域（大腿內(nèi)外側(cè)或者腹部），患者取仰臥位，給予靜脈麻醉，麻醉后將吸脂區(qū)常規(guī)消毒鋪巾。于進(jìn)針孔（腹部選擇臍旁，大腿選擇髂前上棘處）皮下注入1%鹽酸利多卡因注射液1 ml行局部麻醉，采用11號(hào)尖刀片作長5 mm切口。采用直徑為2mm的多孔注水麻醉針管行局部腫脹麻醉（腫脹麻醉配置：生理鹽水500 ml+2%鹽酸利多卡因注射液10 ml+1∶1000鹽酸腎上腺素注射液1 ml），于皮下脂肪層均勻注入麻醉液，注射量為200 ml左右。待腫脹液充分起效后，用10 ml注射器連接直徑3 mm雙邊開孔的三孔頓頭吸脂針管，用一定負(fù)壓抽吸皮下脂肪組織。

1.2.2 脂肪純化 將抽取的脂肪靜置10 min，待脂肪組織與腫脹液分離，將下層腫脹液去除后對(duì)上層脂肪進(jìn)行純化。純化后每例患者得到的脂肪組織至少為40 ml。將20 ml脂肪組織進(jìn)行離心處理（離心組），800 r/min，離心3 min。將上層的油脂和下層的液體去除，對(duì)中層的脂肪顆粒細(xì)胞進(jìn)行活性檢測；另將20 ml脂肪組織進(jìn)行過濾吸附處理（過濾吸附組），將脂肪倒入無紡布上（下墊襯紗布），對(duì)脂肪組織進(jìn)行輕輕搖晃以使脂肪顆粒中的油脂、生理鹽水、局部麻醉藥液等被紗布吸附（圖1）。

圖1 脂肪處理方法 a.離心法 b.離心處理后的脂肪組織 c.過濾吸附法 d.過濾吸附后的脂肪組織

1.2.3 葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)法檢測脂肪細(xì)胞活性 將獲取的備用脂肪經(jīng)離心和過濾吸附法處理后，分別取純化好的脂肪顆粒細(xì)胞5 ml加入培養(yǎng)皿中，每皿中加入10 ml低糖（1000 mg/L）DMEM培養(yǎng)基，1U普通胰島素。同時(shí)設(shè)置一空白組，只含胰島素和DMEM培養(yǎng)基，不含脂肪顆粒細(xì)胞。所有標(biāo)本搖勻后置于37℃、95%CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育1 h。1 h后取出，用生化分析儀檢測DMEM培養(yǎng)基中葡萄糖濃度?？瞻捉M中葡萄糖的濃度設(shè)置為基礎(chǔ)濃度，基礎(chǔ)濃度與每個(gè)實(shí)驗(yàn)組的濃度差值表示葡萄糖轉(zhuǎn)移量，即代表脂肪顆粒細(xì)胞的活性。

1.2.4 錐蟲藍(lán)染色法檢測脂肪細(xì)胞存活率 分別取經(jīng)離心和過濾吸附處理后的脂肪顆粒1 ml，加入等體積的0.1%Ⅰ型膠原蛋白酶，充分混勻后置于37℃、95%CO2恒溫培養(yǎng)箱中消化40 min。消化后用200目金屬過濾篩進(jìn)行過濾，過濾后的細(xì)胞懸液進(jìn)行離心（1000 r/min，離心10 min）。離心完后吸取第2層脂肪細(xì)胞與0.4%錐蟲藍(lán)染液以9:1充分混勻，染色3～5 min。采用標(biāo)準(zhǔn)計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.5 HE染色 分別取經(jīng)離心和過濾吸附處理好的脂肪顆粒5 ml，用10%甲醛溶液進(jìn)行固定。常規(guī)脫水、包埋、切片，行HE染色。用光學(xué)顯微鏡對(duì)脂肪細(xì)胞形態(tài)變化和破壞程度進(jìn)行觀察。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，使用GranphPad Prism5.0軟件進(jìn)行繪圖分析。數(shù)據(jù)采用±s表示，兩組葡萄糖轉(zhuǎn)移量差異采用方差分析，脂肪細(xì)胞存活率差異采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)

過濾吸附組和離心組葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)量分別為（2.0±0.36）mmol/L 和（1.5±0.25）mmol/L，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），見圖2。表明過濾吸附法處理的脂肪細(xì)胞活性較高。

圖2 各組葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)量（*為兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.001）

2.2 錐蟲藍(lán)染色實(shí)驗(yàn)

過濾吸附組和離心組脂肪細(xì)胞的存活率分別為（91.0±3.0）%和（85.5±3.2）%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.417），見圖 3。

圖3 各組脂肪細(xì)胞存活率

2.3 HE染色

光學(xué)顯微鏡下觀察顯示脂肪細(xì)胞連接緊密，呈空泡狀，細(xì)胞膜呈紫紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)黑色，居于細(xì)胞一側(cè)。離心組有少量脂肪細(xì)胞存在損傷，細(xì)胞膜破裂不完整；過濾吸附法組脂肪細(xì)胞分布均勻，形態(tài)保持完整，基本無損傷（圖4）

圖4 各組脂肪細(xì)胞的組織學(xué)觀察（HE×100） a.離心組 b.過濾吸附組

3 討論

離心可以去除腫脹液、紅細(xì)胞、細(xì)胞碎片和油脂而濃縮脂肪細(xì)胞，也可通過去除紅細(xì)胞和非活性成分減少炎癥反應(yīng)而減少吸收[9]。但離心過程較繁瑣，并且Ferraro等[8]在對(duì)離心轉(zhuǎn)速的對(duì)比研究中發(fā)現(xiàn)，高速離心（3000 r/min）會(huì)顯著的降低脂肪細(xì)胞的活性，而低速離心（500 r/min）對(duì)脂肪細(xì)胞僅造成很小的影響。Kuran等[10]提出一種簡單省時(shí)的脂肪處理方法，采用清洗聯(lián)合濾網(wǎng)過濾、棉墊吸附的方法，去除脂肪中的血液、油脂等，只通過重力和棉墊的虹吸作用處理脂肪，不對(duì)脂肪行過多的外力干預(yù)。Pfaff等[6]比較了離心法（1500 r/min）和過濾吸附法處理脂肪顆粒后脂肪細(xì)胞的活性，發(fā)現(xiàn)過濾吸附法處理的脂肪細(xì)胞較離心法處理的脂肪細(xì)胞有更多的脂肪來源干細(xì)胞和有活性的脂肪細(xì)胞。Fisher等[7]進(jìn)行了體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，將過濾吸附法和3000 r/min、離心3 min處理的脂肪顆粒分別注入裸鼠中，6周后對(duì)移植脂肪的體積進(jìn)行測量，發(fā)現(xiàn)過濾吸附法處理的脂肪體積較離心法處理的脂肪體積高。Xie等[11]也比較了離心速率對(duì)脂肪細(xì)胞活性的影響，當(dāng)離心速率達(dá)到1000 r/min時(shí)就會(huì)降低細(xì)胞活性，并且與速率成正比關(guān)系。因此,本研究中我們比較了低速離心（800 r/min）與過濾吸附法處理脂肪細(xì)胞后脂肪細(xì)胞的活性。

本研究結(jié)果顯示，經(jīng)離心和過濾吸附法處理脂肪顆粒細(xì)胞后，過濾吸附組葡萄糖轉(zhuǎn)移量較離心組高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這表明過濾吸附組的細(xì)胞活性較高；對(duì)細(xì)胞消化后行錐蟲藍(lán)染色觀察細(xì)胞的存活率發(fā)現(xiàn)，過濾吸附組脂肪細(xì)胞平均存活率雖然較離心組高，但兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。分析出現(xiàn)此種差異的原因，我們認(rèn)為低速離心時(shí)產(chǎn)生的離心力對(duì)脂肪細(xì)胞的機(jī)械損傷不足以破壞大部分脂肪細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，但卻減弱了脂肪細(xì)胞的活力，從而減弱脂肪細(xì)胞的代謝能力。從組織學(xué)觀察結(jié)果也可看出，過濾吸附法處理脂肪組織后脂肪細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)保持更加完整。

本研究的局限性在于樣本量較小，并且缺少體內(nèi)的自體脂肪移植數(shù)據(jù)。但是，綜合之前學(xué)者的研究結(jié)果，我們認(rèn)為過濾吸附法是一種有效可行的脂肪處理方法。

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Comparison of the effects of centrifugation and filtration on the adipose tissue

LIU Feng,WANG Na,SHI Heng,WANG Zhi-jun.(Department of Plastic Surgery,Xinhua Hospital,Dalian University,Dalian 116021,China)

ObjectiveTo compare the effects of the low-speed centrifugation (800 r/min)method and the filtration adsorption method on the viability of autologous fat grafts.MethodsFat tissue was harvested from 16 healthy patients by syringe aspiration.Harvested fat tissue was prepared using two different methods:centrifugation and filtration adsorption.Glucose transport test and trypan blue stain were performed to evaluate the viability of fat grafts.ResultsThe results of the glucose transportation test of the centrifugation group and the filtration adsorption group was(2.00±0.36)mmol/L and(1.5±0.25)mmol/L,respectively.The viability of lipocyte in filtration adsorption was significantly higher than that in the centrifugation group(P＜0.05).The survival rate of fat is(91.0±3.0)%and(85.5±3.2)%,respectively.There was no significant difference between the two different methods of fat processing (P=0.417).ConclusionLipocyte purification by filtration adsorption has a higher viability than centrifugation.It is an efficient and feasible fat processing method.

Autologous fat grafts;Centrifugation;Filtration adsorption;Cell viability;Fat purification

WANG Zhi-jun,Email:wzy618@tom.com

2016-11-16）

10.3969/j.issn.1673-7040.2017.01.012.

10.3969/j.issn.1673-7040.2017.01.012

大連大學(xué)附屬新華醫(yī)院 整形外科，遼寧 大連 116021

王志軍，Email:wzy618@tom.com

本文引用格式：劉鋒，王娜，石恒，等.離心法與過濾吸附法處理脂肪組織對(duì)脂肪細(xì)胞活性影響的比較[J].中國美容整形外科雜志,2017,28(1):43-45.