陳偉王棽陳驍俊馬建華林力辛宇柴崗張艷

·論著—數(shù)字化醫(yī)學(xué)專題·

人皮膚顯微結(jié)構(gòu)三維可視化方法的初步研究與建立

陳偉*1王棽*1陳驍俊1馬建華2林力1辛宇1柴崗1張艷1

目的 建立一種基于計算機圖形學(xué)實現(xiàn)人類皮膚顯微結(jié)構(gòu)三維可視化的方法。方法 取1例接受除皺術(shù)的女性患者頭皮及皮下組織，做連續(xù)石蠟切片并行HE染色，每層切片厚約4 μm，20倍顯微鏡下按切片順序獲得原始皮膚二維圖像共100張，像素為1280×960。將連續(xù)二維圖像利用ImageJ軟件進行人工配準(zhǔn)，消除切片及拍照過程中發(fā)生的圖片變形，基于不同圖像特征對不同組織結(jié)構(gòu)進行標(biāo)定，設(shè)定局部閾值區(qū)間并重建三維圖像。結(jié)果 成功獲得可用ImageJ軟件進行動態(tài)顯示的局部皮膚三維顯微結(jié)構(gòu)，且可重建各角度平面二維結(jié)構(gòu)；另可構(gòu)建動畫顯示文件（.gif）與視頻顯示文件（.avi），可用各類常見軟件播放。結(jié)論 初步建立了皮膚顯微結(jié)構(gòu)三維可視化方法，模擬了皮膚中各種細胞的空間分布情況，為最終實現(xiàn)皮膚細胞三維生物打印奠定基礎(chǔ)。

三維數(shù)字重建；皮膚顯微結(jié)構(gòu)；ImageJ；三維細胞生物打印

近年來，隨著3D生物打印技術(shù)的出現(xiàn)和迅猛發(fā)展，其在臨床皮膚缺損修復(fù)中的應(yīng)用不斷推陳出新，為解決供體皮膚組織受限和皮膚創(chuàng)面修復(fù)帶來了新的曙光[1]。目前，3D打印修復(fù)皮膚缺損的方法以體外培養(yǎng)細胞、構(gòu)建皮膚替代物后移植覆蓋創(chuàng)面為主，按目前體外培養(yǎng)的條件，無法模擬細胞在體內(nèi)環(huán)境所達到的成熟分化程度，同時也無法在皮膚構(gòu)建中將各要素按體內(nèi)組織的結(jié)構(gòu)精確定向分配在三維復(fù)合物中，細胞之間的相互作用更是無法實現(xiàn)。Michael等[2]應(yīng)用激光生物打印機制作的由20層角質(zhì)細胞、20層成纖維細胞和Matriderm?組成的皮膚類似物移植后存活良好，但新生皮膚缺乏皮膚附屬結(jié)構(gòu)、無相應(yīng)生理功能，與理想的皮膚替代物仍有差距。生物打印技術(shù)可以實現(xiàn)成纖維細胞、表皮細胞，生長因子的分層打印，將其精確定位于組織缺損原位，做到生物打印原位修復(fù)，有望精確構(gòu)建皮膚層次、重構(gòu)皮膚附屬器，其成功有賴于3D生物打印機對微細結(jié)構(gòu)打印精確度的提升和正常皮膚生理結(jié)構(gòu)模型的建立[3]。自2016年6月，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院整復(fù)外科運用正常皮膚連續(xù)切片分別行HE染色，將圖像數(shù)據(jù)導(dǎo)入ImageJ軟件進行處理，標(biāo)定表皮、真皮的層次和不同細胞的分布及空間位置，構(gòu)建皮膚三維模型，完成皮膚微觀數(shù)字化三維結(jié)構(gòu)的構(gòu)建。

1 對象與方法

1.1 組織標(biāo)本來源

頭皮標(biāo)本取自在本院接受面部除皺術(shù)的1例45歲女性患者。該患者對其標(biāo)本用于本實驗知情同意。取材后行甲醛固定、石蠟包埋、切片及HE染色等，切片厚4 μm，共制作100張切片。

1.2 圖像處理

1.2.1 二維圖像采集 在20倍顯微鏡下按切片順序進行圖像采集，像素為1280×960，每張原始切片都放置標(biāo)尺，測量后估算每個像素對應(yīng)的切片實際大小約為4 μm×4 μm。共獲得100張圖片。

1.2.2 二維圖像處理 ⑴配準(zhǔn)。連續(xù)切片必須進行圖像配準(zhǔn)，旨在消除切片進行平移時的對位錯誤。在ImageJ軟件中打開第1層及第2層兩張皮膚切片圖像作為圖層1及圖層2，圖層2透明度調(diào)整為50%，移動圖層位置并通過變形功能對兩圖層中皮膚表面高度、毛囊和主要血管進行配準(zhǔn)，抵消切片制作及拍攝過程中造成的皮膚切面變形（圖1a）。連續(xù)觀察3～5張切片，根據(jù)皮膚結(jié)構(gòu)連續(xù)變化的趨勢對因制片過程所導(dǎo)致的明顯變形做出判定。通過調(diào)整使該結(jié)構(gòu)處于前后幾層切片連續(xù)變化中的合理位置，并進一步校準(zhǔn)其空間位置，彌補制片過程中的明顯變形（圖1b）。⑵按上述方法對全部100層皮膚切片圖像進行配準(zhǔn)。⑶利用“Import Image Sequence”功能將100張切片圖像按順序?qū)胲浖?，利用“Crop”功能截取適當(dāng)正方形范圍的圖像（圖1c）。⑷利用“Set Scale”功能設(shè)定標(biāo)尺（圖1d）。⑸利用“Subtract Background”功能清除切片背景雜色，使用“Invert”將圖像調(diào)整為反色，以提高對比度（圖1e）。

1.2.3 三維模型的生成 應(yīng)用ImageJ軟件中的插件“3D Viewer”將連續(xù)切片圖像重建為三維模型，見圖2。

圖1 在ImageJ中對所有二維圖像進行處理 a.旋轉(zhuǎn)、平移 b.調(diào)整至合理位置 c.導(dǎo)入連續(xù)切片 d.設(shè)定標(biāo)尺 e.顏色反轉(zhuǎn)

圖2 ImageJ顯示重建后的皮膚三維顯微結(jié)構(gòu)

2 結(jié)果

在ImageJ軟件中選擇3D Viewer，可瀏覽之前采集的各層二維結(jié)構(gòu)，并重建各角度二維平面結(jié)構(gòu)。另可生成動畫（.gif）及視頻（.avi）文件，可動態(tài)顯示皮膚顯微三維結(jié)構(gòu)。

3 討論

ImageJ軟件是由美國國家健康協(xié)會開發(fā)（NIH），可運行于 Microsoft Windows、Mac OS等多種平臺，除了基本的圖像操作，如縮放、旋轉(zhuǎn)、扭曲、平滑處理外，還能進行圖片的區(qū)域和像素統(tǒng)計，間距和角度計算，柱狀圖和剖面圖的創(chuàng)建，以及傅里葉變換。圖像分析處理功能強大。目前廣泛用于醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、航空等領(lǐng)域[4]。馮愛芬和張永久[5]應(yīng)用ImageJ軟件對顯微鏡下拍攝的織物圖像進行處理分析，快速、有效地統(tǒng)計出織物的孔隙率，具有精度高、再現(xiàn)性好等特點。Cai等[6]利用ImageJ軟件和自定義宏成功地對不同治療方法下乳腺癌細胞gamma-H2AX病灶的數(shù)量、面積和密度進行了定量分析和比較。余琦等[7]提出的基于ImageJ軟件的動脈粥樣硬化病變的圖像分析方法,能夠準(zhǔn)確、有效地評估動脈粥樣硬化病變程度，降低了研究工作難度和成本,并指出此方法能夠推廣到更多的動物模型及臨床組織學(xué)圖像的分析中去。Rha等[8]運用ImageJ軟件分別以面部計算機斷層掃描、乳腺磁共振數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)測量了眼眶容積及乳房體積，并與其他方法測得結(jié)果并無明顯區(qū)別，證明了其在宏觀體積測量中的可靠性。Elsayed等[9]利用ImageJ分析了在微流體環(huán)境下的精子運動模式。根據(jù)以上大量經(jīng)驗，我們可以肯定ImageJ軟件在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域測量細胞相對位置、構(gòu)建三維結(jié)構(gòu)圖的可行性和可靠性。

本研究中，切片圖像中毛囊及皮脂腺等皮膚附屬器的分割采用人工標(biāo)注的半自動分割方法，原因是連續(xù)切片厚度只有4 μm，制作過程中易變形，且HE染色后得到的切片圖像內(nèi)不同結(jié)構(gòu)顏色值相近，自動化分隔極其困難且精度不高；同樣的結(jié)構(gòu)由于切片制作時切割角度不同，在切片上顯示的截面形狀復(fù)雜，造成分割算法很難確定；皮膚結(jié)構(gòu)復(fù)雜，HE染色中除了角質(zhì)細胞、成纖維細胞、毛囊等附屬器之外，背景中充斥著大量膠原纖維染成的均勻粉紅色圖形，因此，分割的最直接而有效的方法是人工對切片逐個進行辨識。這種方法的優(yōu)點是物體分割準(zhǔn)確，能夠排除切片制作過程中皮膚結(jié)構(gòu)變形、染色不均等造成的影響；缺點是時間長，耗精力，不同的人分割的結(jié)果可能不完全相同。

本研究受制于計算機硬件，僅初步驗證了所采用圖像處理方法的可行性。在進一步的研究中，將更新計算機硬件，并逐步實現(xiàn)以下5個目標(biāo)：⑴分辨率更高的顯微結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)采集；⑵細胞標(biāo)記方法多樣化，重建含有更多細胞種類信息的三維結(jié)構(gòu)；⑶采集多人多部位樣本，建立皮膚顯微結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫，用于大數(shù)據(jù)分析；⑷對不同種類細胞進行彩色標(biāo)記，實現(xiàn)細胞空間分布情況可按種類逐個顯示；⑸觀察干細胞及生長因子在皮膚愈合過程中的動態(tài)變化。

皮膚顯微結(jié)構(gòu)三維重建的最終目的是實現(xiàn)皮膚3D細胞打印。3D打印技術(shù)，尤其是近年來新提出的原位3D打印技術(shù)有望成為一種外科修復(fù)重建的全新醫(yī)療模式，盡管仍處在起步階段，但依然具有極大的優(yōu)勢和發(fā)展?jié)摿10-11]。要達到原位打印精確修復(fù)組織缺損的目的，正常組織結(jié)構(gòu)的微觀三維地圖是不可或缺的，以本實驗建立的數(shù)字化皮膚計算機輔助設(shè)計模型為基礎(chǔ)，輔以合適的細胞外基質(zhì)模擬材料——如多孔納米生物材料[12]或靜電紡絲技術(shù)制作的納米級纖維多微孔支架[13]進行的3D打印，能夠準(zhǔn)確模擬成纖維細胞、表皮干細胞在正常皮膚中的空間位置以及生長因子的多濃度梯度，在類似正常生理狀況細胞的微環(huán)境下，表皮干細胞有望分化出皮膚附屬器，構(gòu)建更高質(zhì)量的再生皮膚。然而，本實驗獲得的皮膚三維顯微結(jié)構(gòu)圖仍是不完美的，由于現(xiàn)有切片、染色、抗體標(biāo)記及人工標(biāo)定細胞技術(shù)水平的限制，并不能完全展現(xiàn)生理狀態(tài)下皮膚的狀態(tài)，如黑色素細胞、周圍神經(jīng)細胞等的標(biāo)定和修復(fù)并不是目前3D圖像重建和打印技術(shù)所能達到的。原位3D打印的臨床應(yīng)用也存在如下問題：⑴測量技術(shù)。原位3D打印是生物制造技術(shù)和成像技術(shù)的結(jié)合[14]，3D打印的質(zhì)量依賴于測量技術(shù)對損傷部位實時測量所獲得的打印區(qū)域精確的幾何形狀。⑵無菌環(huán)境。原位3D打印不同于傳統(tǒng)3D打印構(gòu)建的組織工程皮膚，前者的機械結(jié)構(gòu)在治療過程中無可避免地與患者發(fā)生接觸，而手術(shù)環(huán)境的清潔直接決定了打印組織的成活與否。⑶打印材料。3D打印皮膚的最佳材料無疑是表皮干細胞、毛囊干細胞，但是這些細胞的來源和分選方法仍是臨床應(yīng)用的難點。

盡管原位3D打印精確修復(fù)組織缺損的研究困難重重，但憑借其修復(fù)精準(zhǔn)、重構(gòu)組織質(zhì)量優(yōu)異以及有望完成機械化自動控制的優(yōu)點，必將成為學(xué)科發(fā)展的主流趨勢。以本實驗皮膚微觀三維結(jié)構(gòu)圖的成功構(gòu)建為基礎(chǔ)，人體各種器官結(jié)構(gòu)也能準(zhǔn)確構(gòu)建，這將使原位3D打印技術(shù)成為一種高效、精準(zhǔn)的臨床治療手段。

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A preliminary study on three-dimensional visualization of human skin microstructure

CHEN Wei,WANG Shen,CHEN Xiao-jun,MA Jian-hua,LIN Li,XIN Yu,CHAI Gang,ZHANG Yan.(Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People′s Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China)Corresponding author:CHAI Gang,Email:13918218178@163.com;ZHANG Yan,Email:13651817522@163.com

ObjectiveTo establish a digitalized 3D visualization method of human skin microstructure based on computer graphics.MethodsThe scalp and subcutaneous tissues of 1 female patient who underwent rhytidectomy were subjected to continuous paraffin section with HE staining.One hundred digital images(1280×960 pixels)of4 μm slice thickness were photographed under a 20 times microscope.The continuous 2D images were aligned manuallytoeliminate image distortion and the 3D microstructure ofthe skin was reconstructed by ImageJ software.ResultsUsing ImageJ software,the motion 3D display of skin microstructure can be displayed and multi-angular 2Dimages can be reconstructed.Motion and media files(.avi and.gif)were created,which can be opened in various software.ConclusionThis research established a method of skin microstructure 3D visualization.By successfully modeling the space distribution ofskin cells,it is possible torealize skin cell 3Dbio-print in the future.

3Ddigital reconstruction;Skin microstructure;ImageJ;3Dcell biological printing

2016-12-10）

10.3969/j.issn.1673-7040.2017.01.002.

10.3969/j.issn.1673-7040.2017.01.002

國家自然科學(xué)基金面上項目（81372097）；上海市科學(xué)技術(shù)委員會科研計劃項目（14441900800，14441900802）；上海交通大學(xué)“醫(yī)工交叉研究基金”（YG2014MS06）；上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院高峰高原計劃研究型醫(yī)師（20161420）

1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院 整復(fù)外科，上海 200011；2.泰興市人民醫(yī)院神經(jīng)外科，江蘇 泰興 225400

柴崗，Email:13918218178@163.com；

張艷，Email:13651817522@163.com

*共同第一作者

本文引用格式：陳偉,王棽,陳驍俊,等.人皮膚顯微結(jié)構(gòu)三維可視化方法的初步研究與建立 [J].中國美容整形外科雜志,2017,28(1):5-7,11.