周飛燕+孔雯雯+楊麗菲

[摘要]目的 建立注射用重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（rhGM-CSF）凍干粉針劑中主要活性成分的HPLC的測(cè)定方法。方法 HPLC色譜條件中，色譜柱為TSK gel G3000SW（300.0 mm×7.5 mm，5 μm），流動(dòng)相為0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液，流速為1 ml/min，自動(dòng)進(jìn)樣20～40 μl，檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm。研究該色譜條件是否能分析rhGM-CSF凍干粉針劑中的各組分、實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)性以及不同進(jìn)樣體積與各組分峰面積的線性關(guān)系。結(jié)果 檢測(cè)出rhGM-CSF凍干粉針劑中的主成分為rhGM-CSF蛋白和人血白蛋白，rhGM-CSF蛋白進(jìn)樣量與峰面積呈良好線性關(guān)系，R2>0.99，百分含量的RSD值均<3%。結(jié)論 該法可用于檢測(cè)rhGM-CSF凍干粉針劑蛋白量在10～20 μg范圍內(nèi)的的活性成分含量。

[關(guān)鍵詞]重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子；凍干粉針劑；高效液相色譜法

[中圖分類號(hào)] R927.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2017）05（c）-0104-04

[Abstract]Objective To establish the method of the main active ingredients in recombinant human granulocyte macrophage colony stimulating factor freeze-dried powder injection （rhGM-CSF） by HPLC.Methods The chromatographic condition of HPLC was chromatographic column （TSK gel G3000SW，300.0 mm×7.5 mm，5 μm），Mobile phase was 0.1 mol/L phosphate buffer，F(xiàn)low rate was 1 ml / min，automatic sampling was 20-40 μl and detection wavelength was 280 nm.Analyzing the ingredients of rhGM-CSF freeze dried powder injection，reproducibility and linear relationship between different sample volume and peak area of each component under this chromatographic condition were studied in this experiment.Results The main components of rhGM-CSF freeze dried powder injection were rhGM-CSF protein and human albumin.The rhGM-CSF protein sample volume and peak area were good linear （R2>0.99） and the percentage content of RSD values was less than 3%.Conclusion This method could be used to detect the active component content of the rhGM-CSF lyophilized powder for injection protein with 10-20 μg scope.

[Key words]Recombinant human granulocyte macrophage colony stimulating factor；Freeze-dried powder injection；High performance liquid chromatography

重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞刺激因子凍干粉針劑（rhGM-CSF）是使用重組基因工程技術(shù)生產(chǎn)的重組蛋白藥物[1]343-344，是一種細(xì)胞因子，主要用于治療因放、化療引起的白細(xì)胞減少[2-5]，并且臨床上可以治療潰瘍、燙傷、燒傷等創(chuàng)面疾病[6-9]，其活性成分為重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞刺激因子，該品種已被《中國(guó)藥典》三部收載[1]343-344?！吨袊?guó)藥典》未規(guī)定其成品的含量測(cè)定方法，只要求測(cè)定生物學(xué)活性（效價(jià)），采用的是TF-1依賴細(xì)胞株，用MTT染色法進(jìn)行測(cè)定，合格范圍是標(biāo)示活性的80%～150%[10]96-98，277-279。由于活性測(cè)定方法本身的穩(wěn)定性較差，難以實(shí)現(xiàn)精確的控制，因此，為更好地控制產(chǎn)品質(zhì)量，宜盡早建立其主藥成分含量測(cè)定方法。

高效液相色譜法（HPLC）中收載rhGM-CSF原液純度的檢測(cè)方法，是采用凝膠色譜柱為固定相，磷酸鹽緩沖液為流動(dòng)相，在波長(zhǎng)280 nm處進(jìn)行檢測(cè)，使用面積歸一化法計(jì)算目的蛋白百分比含量[10]59-63。目前，高效液相用于藥品的定性、定量的分析應(yīng)用已經(jīng)很廣泛[11-15]，但是用于檢測(cè)rhGM-CSF凍干粉針劑主藥含量的方法尚罕見報(bào)道，故本研究通過參考藥典中rhGM-CSF原液純度檢測(cè)的方法，確認(rèn)該法檢測(cè)rhGM-CSF凍干粉針劑主藥含量的可行性。

1材料與試藥

1.1儀器

Agilent 1100高效液相色譜儀（配有G1315B DAD 檢測(cè)器、G1311A四元梯度泵、G1322A在線脫氣裝置、G1316A柱溫箱，德國(guó)安捷倫科技有限公司）；化學(xué)工作站（ChemStation，版本號(hào)：Rev.A.10.01[1635]，美國(guó)安捷倫科技有限公司）；BS124S型電子天平（德國(guó)賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；TSK gel G3000 SWXL色譜柱（7.8 mm×300 mm，粒徑5 μm，日本東曹株式會(huì)社公司）。

[摘要]目的 建立注射用重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（rhGM-CSF）凍干粉針劑中主要活性成分的HPLC的測(cè)定方法。方法 HPLC色譜條件中，色譜柱為TSK gel G3000SW（300.0 mm×7.5 mm，5 μm），流動(dòng)相為0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液，流速為1 ml/min，自動(dòng)進(jìn)樣20～40 μl，檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm。研究該色譜條件是否能分析rhGM-CSF凍干粉針劑中的各組分、實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)性以及不同進(jìn)樣體積與各組分峰面積的線性關(guān)系。結(jié)果 檢測(cè)出rhGM-CSF凍干粉針劑中的主成分為rhGM-CSF蛋白和人血白蛋白，rhGM-CSF蛋白進(jìn)樣量與峰面積呈良好線性關(guān)系，R2>0.99，百分含量的RSD值均<3%。結(jié)論 該法可用于檢測(cè)rhGM-CSF凍干粉針劑蛋白量在10～20 μg范圍內(nèi)的的活性成分含量。

[關(guān)鍵詞]重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子；凍干粉針劑；高效液相色譜法

[中圖分類號(hào)] R927.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2017）05（c）-0104-04

[Abstract]Objective To establish the method of the main active ingredients in recombinant human granulocyte macrophage colony stimulating factor freeze-dried powder injection （rhGM-CSF） by HPLC.Methods The chromatographic condition of HPLC was chromatographic column （TSK gel G3000SW，300.0 mm×7.5 mm，5 μm），Mobile phase was 0.1 mol/L phosphate buffer，F(xiàn)low rate was 1 ml / min，automatic sampling was 20-40 μl and detection wavelength was 280 nm.Analyzing the ingredients of rhGM-CSF freeze dried powder injection，reproducibility and linear relationship between different sample volume and peak area of each component under this chromatographic condition were studied in this experiment.Results The main components of rhGM-CSF freeze dried powder injection were rhGM-CSF protein and human albumin.The rhGM-CSF protein sample volume and peak area were good linear （R2>0.99） and the percentage content of RSD values was less than 3%.Conclusion This method could be used to detect the active component content of the rhGM-CSF lyophilized powder for injection protein with 10-20 μg scope.

[Key words]Recombinant human granulocyte macrophage colony stimulating factor；Freeze-dried powder injection；High performance liquid chromatography

重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞刺激因子凍干粉針劑（rhGM-CSF）是使用重組基因工程技術(shù)生產(chǎn)的重組蛋白藥物[1]343-344，是一種細(xì)胞因子，主要用于治療因放、化療引起的白細(xì)胞減少[2-5]，并且臨床上可以治療潰瘍、燙傷、燒傷等創(chuàng)面疾病[6-9]，其活性成分為重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞刺激因子，該品種已被《中國(guó)藥典》三部收載[1]343-344。《中國(guó)藥典》未規(guī)定其成品的含量測(cè)定方法，只要求測(cè)定生物學(xué)活性（效價(jià)），采用的是TF-1依賴細(xì)胞株，用MTT染色法進(jìn)行測(cè)定，合格范圍是標(biāo)示活性的80%～150%[10]96-98，277-279。由于活性測(cè)定方法本身的穩(wěn)定性較差，難以實(shí)現(xiàn)精確的控制，因此，為更好地控制產(chǎn)品質(zhì)量，宜盡早建立其主藥成分含量測(cè)定方法。

高效液相色譜法（HPLC）中收載rhGM-CSF原液純度的檢測(cè)方法，是采用凝膠色譜柱為固定相，磷酸鹽緩沖液為流動(dòng)相，在波長(zhǎng)280 nm處進(jìn)行檢測(cè)，使用面積歸一化法計(jì)算目的蛋白百分比含量[10]59-63。目前，高效液相用于藥品的定性、定量的分析應(yīng)用已經(jīng)很廣泛[11-15]，但是用于檢測(cè)rhGM-CSF凍干粉針劑主藥含量的方法尚罕見報(bào)道，故本研究通過參考藥典中rhGM-CSF原液純度檢測(cè)的方法，確認(rèn)該法檢測(cè)rhGM-CSF凍干粉針劑主藥含量的可行性。

1材料與試藥

1.1儀器

Agilent 1100高效液相色譜儀（配有G1315B DAD 檢測(cè)器、G1311A四元梯度泵、G1322A在線脫氣裝置、G1316A柱溫箱，德國(guó)安捷倫科技有限公司）；化學(xué)工作站（ChemStation，版本號(hào)：Rev.A.10.01[1635]，美國(guó)安捷倫科技有限公司）；BS124S型電子天平（德國(guó)賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；TSK gel G3000 SWXL色譜柱（7.8 mm×300 mm，粒徑5 μm，日本東曹株式會(huì)社公司）。

3.2 HPLC檢測(cè)法對(duì)混合組分的適用性

本文采用HPLC法對(duì)rhGM-CSF 凍干粉針劑及其單組分進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，該法可檢測(cè)出rhGM-CSF凍干粉針劑中的主成分rhGM-CSF蛋白和人血白蛋白，各峰之間的分離度較好；HPLC方法的重現(xiàn)性較好，相同進(jìn)樣體積條件下，其峰面積及峰面積百分比的RSD均<1%；不同進(jìn)樣量（20～40 μl）與各組分的峰面積顯示明顯線性關(guān)系，R2均>0.99，故該法可用于檢測(cè)rhGM-CSF凍干粉針劑中的活性成分的含量百分比。另外，由于不同樣品的峰面積與其進(jìn)樣量呈一定的線性關(guān)系，還可在一定范圍內(nèi)根據(jù)rhGM-CSF蛋白峰面積的變化，推測(cè)其對(duì)應(yīng)的含量。

應(yīng)用HPLC法檢測(cè)rhGM-CSF凍干粉針劑中rhGM-CSF含量，是原液評(píng)價(jià)的一種直觀、合理、有效的技術(shù)手段，具有重現(xiàn)性好和操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，能很好地滿足質(zhì)控的要求，對(duì)完善該品種的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了參考。

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（收稿日期：2017-03-16 本文編輯：祁海文）