夏潔，程宇豪，章杭，錢漢清，劉寶瑞

（1.南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院腫瘤中心/南京大學臨床腫瘤研究所，江蘇南京210008；2.南京大學醫(yī)學院醫(yī)藥生物技術國家重點實驗室，江蘇南京210029）

基于腫瘤細胞膜納米載藥系統(tǒng)的構建及評價

夏潔1，程宇豪2，章杭1，錢漢清1，劉寶瑞1

（1.南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院腫瘤中心/南京大學臨床腫瘤研究所，江蘇南京210008；2.南京大學醫(yī)學院醫(yī)藥生物技術國家重點實驗室，江蘇南京210029）

目的研究并明確腫瘤細胞膜納米粒載藥系統(tǒng)的體外應用價值。方法本實驗設計并成功構建了一種新型腫瘤細胞膜納米粒載藥系統(tǒng)。該系統(tǒng)以腫瘤細胞膜為載體，以聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）為內核，負載香豆素-6（Coumarin-6）作為熒光探針。在體外通過流式細胞儀及激光共聚焦成像分析并評價腫瘤細胞膜納米粒（CNPs）及紅細胞膜納米粒（RNPs）、脂質體納米粒（LNPs）在腫瘤細胞中的攝取差異。結果CNPs可粘附到腫瘤細胞表面，且腫瘤細胞對CNPs攝取最多。結論腫瘤細胞膜納米粒載藥系統(tǒng)在腫瘤靶向遞藥領域具有應用前景。

遞藥系統(tǒng)；腫瘤細胞膜；粘附；靶向

目前，對基于天然生物膜材料藥物載體的研究得到較大關注。紅細胞膜[1-2]、白細胞膜[3]、血小板膜[4-5]等均被應用于構建納米載藥系統(tǒng)，且在體內外均表現(xiàn)出各自所來源細胞的特性。例如紅細胞膜納米載藥系統(tǒng)表現(xiàn)出長循環(huán)特性[1]、白細胞膜納米載藥系統(tǒng)體現(xiàn)了白細胞的炎癥驅化特性[3]等。但在腫瘤靶向遞藥上，上述細胞膜載藥系統(tǒng)均沒有太大作為。紅細胞膜載體雖實現(xiàn)了體內長循環(huán)，但對腫瘤病灶并未表現(xiàn)出明顯的靶向性。白細胞載體僅表現(xiàn)出對炎癥部位的靶向。而與此同時，腫瘤細胞因其較強的細胞粘附特性而被廣泛研究[6-7]。腫瘤細胞膜上常高表達Ca2+依賴性蛋白[8-10]，介導腫瘤細胞膜之間的相互粘附及靶向。在體內，該粘附特性促使腫瘤細胞之間相互識別并粘附，抵抗失巢凋亡[11]；在體外，該粘附特性導致腫瘤細胞相互粘附并自組裝成細胞球，成團生長[12]。因此，腫瘤細胞膜作為藥物載體表現(xiàn)出較強的腫瘤靶向潛力。通過細胞裂解、梯度離心等一系列步驟，腫瘤細胞膜可被完好剝離，并保留有靶向粘附特性。當被用作納米藥物載體后，該載體系統(tǒng)便具有獨特的靶向粘附能力。

本實驗采用A549、Hela細胞膜作為腫瘤細胞膜載體，以負載香豆素-6的PLGA納米粒作為內核，構建新型腫瘤細胞膜納米粒（CNPs）的靶向輸送系統(tǒng)。通過與紅細胞膜納米載藥系統(tǒng)(RNPs)、脂質體納米載藥系統(tǒng)(LNPs)對比，評價CNPs體外靶向應用價值。實驗表明，該新型生物膜載藥系統(tǒng)在腫瘤細胞靶向性方面具有一定的優(yōu)越性。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器PLGA（LA/GA=50:50）購自美國Lactel Absorbable Polymers公司，香豆素-6購自上海阿拉丁生物科技股份有限公司；二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇2000（DSPE-PEG-2000）購自深圳艾維特科技有限公司；膽固醇及大豆卵磷脂購買自南京化學試劑公司；癌胚抗原（CEA）及β-肌動蛋白（β-actin）抗體購自英國Abcam公司；Mini蛋白酶抑制劑購買自瑞士羅氏公司；電泳試劑盒購買自南京凱基生物公司；RPMI-1640培養(yǎng)基購自文森特生物技術南京有限公司，小牛血清、胰蛋白酶購自杭州四季青生物公司；BCA蛋白檢測試劑盒購自碧云天生物公司。

實驗所用儀器為Beckman T40i超速離心機，Brookhaven 90Plus粒徑儀，Olympus FV10i激光共聚焦顯微鏡，BD FACSCalibur流式細胞儀。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及準備人宮頸癌Hela細胞、人肺癌A549細胞購自美國模式菌種收集中心。細胞在含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，37℃、5%CO2全濕度培養(yǎng)。待細胞匯合度達80%～90%，使用含2mm乙二胺四乙酸（EDAT）的PBS溶液消化。消化的細胞經(jīng)1 000 rpm×3min離心沉淀及1×PBS溶液洗滌3遍后，4瓶細胞沉淀收集備用。

1.2.2 腫瘤細胞膜提取將上述腫瘤細胞分散于2mL含有蛋白酶抑制劑的10%蔗糖低滲液。冰中靜置30min，使用高速分散儀（100 000 rpm×3 min）攪拌、勻漿。勻漿液經(jīng)1 500 rpm×5min離心后，收集上清液。剩余沉淀重復上述步驟5～6次后，收集所有細胞裂解液并保存冰上。

將上述細胞裂解液用蔗糖溶液（55%wt,40%wt,30%wt）進行超速梯度離心（28 000 g×30min）。收集30%～40%界面組分，并以28 000 g離心10min收集沉淀。將沉淀用去離子水洗滌2次即得到提取的腫瘤細胞膜。

1.2.3 紅細胞膜的提取取人血3mL離心，去除血漿。得到的紅細胞用1×PBS洗滌3次后，分散于0.25×PBS中，并于冰中靜置裂解2 h。裂解液經(jīng)10 000 g離心10min后，用1×PBS洗滌3次即得到紅細胞膜。

1.2.4 脂質體的制備取膽固醇6.42mg、卵磷脂36.9mg、DSPE-PEG-2000 5.7mg溶解在二氯甲烷中。真空旋干后，加入3mL純水水化。后在冰水中超聲(500W,5min)，即得到脂質體。

1.2.5 PLGA納米粒的制備10mg PLGA與0.05%wt的香豆素-6共同溶于2mL丙酮，并逐漸滴加在6mL去離子水中。常溫下攪拌1 h，抽真空攪拌3 h以充分去除丙酮。最后得到香豆素標記的PLGA納米粒子。

1.2.6 膜納米粒的制備將腫瘤細胞膜用BCA蛋白定量法進行蛋白定量。取等量負載香豆素-6的PLGA與腫瘤細胞膜溶液充分混勻。并使用脂質體擠出儀，依次擠過400 nm和200 nm的膜，最后即得到腫瘤細胞膜包裹PLGA的納米粒子（CNPs）。采用同樣方法制備紅細胞膜納米粒子(RNPs)及脂質體納米粒子(LNPs)。

1.2.7 納米粒子的表征

（1）平均粒徑、表面電荷：納米粒子粒徑及表面電荷利用Brookhaven 90Plus粒徑儀測定，測試條件為：室溫，1mg/mL樣品1.25～1.8mL。

（2）形貌評價：采用透射電子顯微鏡觀察納米粒子的形貌。將覆有支持膜的銅網(wǎng)置于CNPs中反復撈3次，吸水紙吸去多余水分。自然干燥后，在Olympus FV10激光共聚焦顯微鏡上觀察。

1.2.8 SDS-PAGE電泳及Western blot分析將A549細胞裂解物及A549細胞膜提取物濃度均稀釋成1mg/mL。取適量樣品加入上樣緩沖液，100℃沸水中煮沸10min。分別添加20μL樣品在10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳樣品槽內。通電分離蛋白組分。使用SimplyBlue對凝膠進行染色，并在水中脫色過夜。

凝膠上蛋白轉至聚偏氟乙烯膜上。使用CEA抗體、Beta-actin抗體作為一抗與膜在4℃共孵育過夜。洗滌3遍后與二抗在室溫下共孵育1 h。再洗滌3遍。通過Tanon 4200化學發(fā)光成像系統(tǒng)對聚偏氟乙烯膜進行拍照采集數(shù)據(jù)。

1.2.9 流式分析2×106個A549細胞及Hela細胞分別接種在六孔板中，鏡下觀察細胞生長匯合度在80%左右，使用無血清培養(yǎng)基洗滌3遍。將香豆素-6標記的A549細胞膜納米粒（ANPs）、Hela細胞膜納米粒（HNPs）及LNPs按照PLGA的濃度均稀釋為1mg/mL，并每孔300μL依次加入6孔板內，置于培養(yǎng)箱共培養(yǎng)2 h。棄去培養(yǎng)基后，依次用無血清培養(yǎng)基和1×PBS洗滌，加入0.5mL胰酶消化。收集細胞，1000 rpm× 3min離心沉淀，并用1mL 1 640培養(yǎng)基重懸。使用BD FACSCal ibur流式細胞儀對樣品進行數(shù)據(jù)采集。

1.2.10 激光共聚焦成像1×105個A549細胞及Hela細胞分別接種在24孔板中，鏡下觀察細胞匯合度在60%左右后，使用無血清培養(yǎng)基洗滌3遍。150μL、1mg/mL ANPs、HNPs、RNPs、LNPs分別依次加入24孔板中。置于培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)2 h。吸去培養(yǎng)基后，1×PBS洗滌1遍，加入4%的多聚甲醛溶液500μL固定10 min。1×PBS洗滌1遍后，加入hoechst33342染料染色10min。1×PBS再洗滌3遍。通過Olympus FV10i激光共聚焦顯微鏡觀察細胞對納米粒子的攝取。

2 結果

2.1 CNPs的表征粒徑儀檢測結果顯示，PLGA內核的粒徑為（117.00±0.23）nm，提取的腫瘤細胞膜載體的粒徑為（330.00±0.82）nm，CNPs的粒徑為（141.00±0.19）nm（見圖1A）。電勢檢測表明，PLGA內核的電勢（-37.0±0.6）mV，CNPs的電勢（-20.00±0.53）mV，與腫瘤細胞膜載體的電勢（-21.7±0.9）mV相近（見圖1B）。證明腫瘤細胞膜已成功地包裹在PLGA的外表面。透射電鏡較直觀地展現(xiàn)出CNPs的“殼核”結構（見圖1C），也證明了PLGA粒子已被腫瘤細胞膜成功包被。此外，通過透射電鏡也可看到，膜結構幾乎存在于所有的納米粒子外表面，所制備的CNPs的粒徑均一性及粒子分散性均較好。

為明確腫瘤細胞膜上蛋白保留情況，實驗中將腫瘤細胞裂解液及所提取TCM同時做凝膠電泳分析。見圖2，腫瘤細胞裂解液與TCM共有一些條帶。但與細胞裂解液相比，TCM缺失部分條帶。進一步做Western blot分析發(fā)現(xiàn)，作為細胞膜蛋白表達指標的CEA成分共同存在于二者之上。證明實驗所提取的確為腫瘤細胞膜，并且保留有膜上蛋白。但是，細胞骨架蛋白Beta-actin作為細胞質蛋白指標，較多存在于腫瘤細胞裂解液的條帶上，細胞膜提取物所含較少。因此表明，通過低滲裂解并梯度離心后，腫瘤細胞質成分被基本去除，而腫瘤細胞膜上蛋白仍繼續(xù)保留在膜表面。見圖3。

2.2 CNPs對腫瘤細胞具有較強靶向性為明確CNPs對腫瘤細胞的靶向性，我們設計多種香豆素-6標記的CNPs，包括A549膜納米粒子（ANPs），Hela細胞膜納米粒子（HNPs）以及紅細胞膜納米粒子（RNPs）,脂質體納米粒子（LNPs）,通過觀察A549、Hela細胞對上述粒子的攝取，評價CNPs在腫瘤細胞中的靶向性。

將上述粒子分別與Hela、A549細胞共孵育2h后，通過流式細胞分析數(shù)據(jù)顯示：Hela及A549細胞中添加HNPs及ANPs的4組實驗組均表現(xiàn)出較高的熒光強度。但HNPs與ANPs熒光強度之間并未表現(xiàn)出明顯的差異。LNPs組在兩種腫瘤細胞中的熒光強度均較弱，僅強于空白細胞對照組。結果表明，Hela細胞及A549細胞均對CNPs具有更高的攝取率。見圖4。

圖1 CNPs的表征:粒徑(A)、表面電勢(B)、透射電鏡(C)Figure1 The characteristic of CNPs,including size(A),surface charge(B),transmission electronmicroscopy imaging(C)

圖2 細胞裂解物及細胞膜提取物的SDS-PAGE分析Figure2 The SDS-PAGE analysisofboth cell lysatesand cell membraneextraction

圖3 細胞裂解物及細胞膜提取物的Western Blot分析Figure3Thewestern blotanalysisofboth cell lysatesand cell membraneextraction

圖4 流式細胞分析反映腫瘤細胞對納米粒子的攝取Figure 4 Theuptake differencesof nanoparticlesby cancer cellswere reflected by flow cytometry analysis

本研究進一步利用激光共聚焦顯微鏡觀察了腫瘤細胞對納米粒的攝取情況，見圖5A：CNPs組的腫瘤細胞內表現(xiàn)出較強的綠色熒光，RNPs組相對熒光較弱，LNPs實驗組則幾乎無熒光。使用imangJ軟件對熒光量進行分析，通過計算視野中綠色熒光與細胞個數(shù)的比值，反映出各個組之間的熒光差異，見圖5B：CNPs組的熒光量均高于RNPs組，LNPs組最弱。該結果進一步說明腫瘤細胞對CNPs有更高的親和力。CNPs在腫瘤細胞中的攝取強于RNPs及LNPS。

2.3 CNPs對腫瘤細胞具有粘附性為進一步探討CNPs與腫瘤細胞之間高親和力的原因，本實驗使用激光共聚焦顯微鏡對Hela細胞的四個實驗組進行進一步成像分析。通過隨機選取細胞視野并放大拍攝倍率，觀察CNPs與腫瘤細胞之間相互關系；見圖5C：HNPs及ANPs組均可看到明顯的綠色熒光環(huán)繞在Hela細胞表面，同時Hela細胞內部也散在綠色熒光；RNPs組中，Hela細胞外表面及細胞內部綠色熒光均較弱；LNPs組中，Hela細胞外表面幾乎無綠色熒光，僅細胞內部散在少許微弱熒光。結果表明，CNPs可粘附在腫瘤細胞表面，RNPs較少粘附在腫瘤細胞表面，LNPs幾乎無粘附作用。此外，腫瘤細胞對粒子的吞噬量與各粒子的細胞粘附性成正比，腫瘤細胞對CNPs攝取最多。

3 討論

腫瘤細胞膜因其天然的粘附能力可以被應用于藥物遞送領域。腫瘤細胞膜上表達多種細胞粘附分子，通過同質或異質粘附作用，促使腫瘤細胞膜粘附在一起[13-15]。這種粘附特性使得利用腫瘤細胞膜構建的藥物載體，在腫瘤靶向藥物遞送上具有較好的前景[16]。使用腫瘤細胞膜負載納米藥物，可增強納米載藥系統(tǒng)的主動靶向性[10,17]，提高藥物投遞效率。相較于RNPs及LNPs對腫瘤細胞的低親和力，CNPs便可因其獨特的粘附特性更好的錨定到腫瘤病灶。通過本實驗證明，CNPs可靶向粘附到腫瘤細胞表面，并且腫瘤細胞確對CNPs有更多的攝取，優(yōu)于RNPs及LNPs。

圖5 腫瘤細胞對納米粒子的攝取差異（A、B）及粘附程度（C）Figure5 Tumor celluptakeof nanoparticles(A,B)and adhesion(C)

因此，當腫瘤細胞膜載體應用到納米載藥系統(tǒng)后，一方面，腫瘤細胞膜載體可以攜帶負載藥物靶向投遞，實現(xiàn)低藥物副作用、高藥物殺傷效率；另一方面，因其較強的粘附作用，腫瘤細胞膜載體可粘附到游離腫瘤細胞表面，并投遞負載藥物，實現(xiàn)殺傷，減少腫瘤血行播散的機會。但是，腫瘤細胞膜載體仍有許多問題亟待解決：一是腫瘤細胞膜的抗原免疫性未被驗證。腫瘤細胞膜上表達多種特異性抗原，能激活淋巴系統(tǒng)，產(chǎn)生特異性及非特異性細胞免疫。外源性腫瘤細胞膜納米粒的體內注射可能會引起一系列免疫不良反應。然而，使用內源性腫瘤細胞膜載體面臨著獲取困難，獲取量少的問題。二是腫瘤細胞膜提取的純凈度仍需提高。腫瘤細胞膜在提取過程中，不可避免的混雜有DNA或RNA片段及活性蛋白質，具有安全風險，因此在制備過程中仍需繼續(xù)完善工藝。

目前腫瘤細胞膜納載體的研究仍然處于起步階段，未來更多更深入的研究仍需進一步推進。

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Preparation and application assessmenton drug delivery system of cancer cellmembrane coated nanoparticles

Xia Jie1,Cheng Yu-hao2,Zhang Hang1,Qian Han-qing1，Liu Bao-rui1
（1.The Comprehensive Cancer Centerof Drum Tower Hospital,Medical Schoolof Nanjing University and ClinicalCancer Instituteof Nanjing University,Nanjing,Jiangsu,210008,China；2.State Key Laboratory of Pharmaceutical Biotechnology,Nanjing University,Nanjing,Jiangsu, 210093，China）

Objective For investigating and assessing theapplication of cancer cellmembrane coated nanoparticles(CNPs).Methods In this research,we designed a innovative nanoparticlew ith cancer cellmembrane coating and coumarin-6 labled PLGA core.We evaluated the uptake between CNPsand non-CNPs(including red blood cellmembrane coated nanoparticlesand liposome nanoparticles)of cancer cells in vitro,by flow cytometry analysis and fluorescently confocal imaging.Resu lts Through data analysis,we found that CNPs could specially adhere to the surface of cancer cells,and were swallowedmore than others by cancer cells.Conclusion CNPshave a prom ising application prospective in tumor-targeted drug delivery.

Drug delivery system;Cancer cellmembrane;Adhesion;Targeting

國家自然科學基金青年科學基金項目(81602106)

錢漢清，E-mail：qianhanqing1986@126.com；劉寶瑞，E-mail:baoruiliu@nju.edu.cn