韋 誠，李成龍,2，朱麗娟，謝月英，周才瓊,*

（1.西南大學食品科學學院，重慶 400715；2.重慶啤酒股份有限公司，重慶 401555）

發(fā)酵酸肉膽酸鹽結(jié)合肽的化學抗氧化作用及對大鼠胸主動脈血管內(nèi)皮細胞的影響

韋 誠1，李成龍1,2，朱麗娟1，謝月英1，周才瓊1,*

（1.西南大學食品科學學院，重慶 400715；2.重慶啤酒股份有限公司，重慶 401555）

本實驗對發(fā)酵酸肉膽酸鹽結(jié)合肽（分子質(zhì)量范圍265～1 400 D，肽含量75.7%）的化學抗氧化作用及其對血管內(nèi)皮細胞的影響進行研究。結(jié)果表明，發(fā)酵酸肉膽酸鹽結(jié)合肽化學抗氧化活性隨處理濃度升高而增加，對?OH、O2－?和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基的半清除濃度分別為2.04、2.79、2.50 mg/mL，表明其對?OH有更好的清除效果。對大鼠胸主動脈血管內(nèi)皮細胞的影響研究結(jié)果顯示，在實驗質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，樣品肽對血管內(nèi)皮細胞不具有明顯毒性，可刺激血管內(nèi)皮細胞NO的釋放和6-酮-前列腺素F1α的分泌，高劑量組刺激分泌效果顯著高于空白組。實驗表明酸肉膽酸鹽結(jié)合肽可通過抗氧化活性和對血管內(nèi)皮細胞的作用預防心血管疾病。

發(fā)酵酸肉；膽酸鹽結(jié)合肽；化學抗氧化作用；血管內(nèi)皮細胞；前列環(huán)素

韋誠, 李成龍, 朱麗娟, 等. 發(fā)酵酸肉膽酸鹽結(jié)合肽的化學抗氧化作用及對大鼠胸主動脈血管內(nèi)皮細胞的影響[J]. 食品科學, 2017, 38(11): 225-230. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201711036. http://www.spkx.net.cn

WEI Cheng, LI Chenglong, ZHU Lijuan, et al. Chemical antioxidant effect of bile acid salt binding peptide from fermented sour meat and its effect on rat thoracic aorta endothelial cells[J]. Food Science, 2017, 38(11): 225-230. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201711036. http://www.spkx.net.cn

高脂血癥是當前社會極其常見的一種疾病，中國健康調(diào)查報告（2015）顯示我國現(xiàn)有高脂血癥患者約1億多人，其直接引起的心腦血管疾病如動脈粥樣硬化等已對人類健康構(gòu)成了嚴重威脅。目前對于高血脂癥的治療以藥物為主，像辛伐他汀、考來烯胺、普伐他汀等都是降血脂的常用藥物，雖具有一定的效果，但難免有一定的副作用。因此，天然降血脂劑的研發(fā)引起廣泛重視。大量研究發(fā)現(xiàn)，多種膳食蛋白的酶解產(chǎn)物中含有能有效降低機體血脂水平的肽，其中降膽固醇的活性肽主要通過阻斷體內(nèi)膽固醇的生物合成、抑制膽固醇的吸收以及對膽固醇7α-羥化酶表達的調(diào)節(jié)發(fā)揮作用[1-3]。

發(fā)酵食品由于風味獨特、耐貯藏，有的還含有降膽固醇、抗衰老、免疫調(diào)節(jié)等生理功效的活性物質(zhì)，深受人們喜愛。酸肉是西部少數(shù)民族地區(qū)以豬肉為原料，添加米粉和食鹽后經(jīng)厭氧發(fā)酵而成的自然乳酸發(fā)酵食品，酸肉在發(fā)酵過程微生物大量生長繁殖，肌原纖維蛋白、肌漿蛋白等發(fā)生了降解，非蛋白氮增加[4-5]，并有降血脂作用[6]。此外，也有一些文獻報道豬肉及其制品含有輔助降血脂的功能肽[7-8]。為此，本研究對發(fā)酵酸肉降血脂肽進行了分離純化，得到有膽酸鹽結(jié)合能力的肽——膽酸鹽結(jié)合肽，為酸肉有關(guān)降血脂的功能化開發(fā)提供支持。

氧化應激的增強在動脈粥樣硬化起始階段起關(guān)鍵性作用，自由基和脂質(zhì)過氧化是其主要原因，進而增加動脈粥樣硬化風險[9-12]，因此具有一定自由基清除活性的物質(zhì)也具有一定的調(diào)節(jié)血脂紊亂和抗動脈粥樣硬化病變的作用。血管內(nèi)皮細胞（vascular endothelial cell，VEC）的功能損傷是動脈粥樣硬化形成的始動環(huán)節(jié)。膽酸鹽結(jié)合肽通過結(jié)合膽固醇起到降膽固醇效果，考慮生物活性肽可能具有多種重要的生 物學功能，如抗氧化活性、降血脂、免疫調(diào)節(jié)、抗微生物活性及抗高血壓活性等[13]。為此，通過從發(fā)酵酸肉中分離純化的膽酸鹽結(jié)合肽作為實驗材料，研究其化學抗氧化作用及對大鼠胸主動脈血管內(nèi)皮細胞的影響，以拓寬膽酸鹽結(jié)合肽可能對心血管影響的抗氧化機制具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

發(fā)酵酸肉膽酸鹽結(jié)合肽由課題組自制，分子質(zhì)量范圍265～1 400 D，肽含量75.7%（其余主要為游離氨基酸）。

DMEN培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS） 美國Hyclone公司；青霉素-鏈霉素溶液碧云天生物技術(shù)研究所；N-1-萘乙二胺鹽酸鹽、對氨基苯磺酸、鄰苯三酚、鄰菲羅啉等（均為分析純） 成都市科龍化工試劑廠；前列環(huán)素測定試劑盒 南京建成生物工程研究所。

Griess試劑：超純水配制的0.1%氮-1-萘乙二胺鹽酸鹽、5%磷酸溶液配制1%對氨基苯磺酸，兩種溶液以體積比1∶1的比例混合即為Griess試劑，限3 h內(nèi)使用。1.2 儀器與設備

UV-2450紫外分光光度計 日本島津公司；全波長酶標儀 美國基因公司；CO2細胞培養(yǎng)箱 美國賽默費世爾科技公司；超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；生物顯微鏡 奧林巴斯（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 膽酸鹽結(jié)合肽的制備

按照文獻[5]的方法制備發(fā)酵酸肉：取發(fā)酵20 d酸肉剔除脂肪和筋膜，生理鹽水洗凈→加pH 7.2磷酸鹽緩沖液→勻漿（18 000 r/min）→靜置20 min，離心（8 000 r/min，20 min），取上清液并過濾→加入約3 倍體積的40%乙醇溶液，4 ℃放置12 h→離心（8 000 r/min，20 min）取上清液→真空濃縮→真空凍干制成干粉→酸肉粗肽→純水配成5 mg/mL溶液→加入0.01 mol/L HCl溶液于37 ℃恒溫振蕩1 h→調(diào)pH值為6.3，加入膽酸鹽再次恒溫振蕩1 h→離心（4 000 r/min，20 min）取上清液，凍干→酸肉膽酸鹽結(jié)合肽。

1.3.2 膽酸鹽結(jié)合肽化學抗氧化作用

1.3.2.1 對?OH的清除作用

采用鄰菲羅啉法[14]進行測定。樣品凍干粉用超純水配成質(zhì)量濃度為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL的樣品液。取5 mmol/L鄰菲羅啉溶液0.6 mL加入試管中，加入0.4 mL磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L，pH 7.4），混勻，加入0.6 mL樣品溶液和0.6 mL乙二胺四乙酸二鈉，混勻后加入5 mmol/L硫酸亞鐵溶液0.6 mL和0.1%的H2O20.8 mL，37 ℃水浴60 min，536 nm波長處測定吸光度（A1），以超純水代替樣品液測定吸光度（A2），以超純水替代H2O2測定吸光度（A3），重復3 次，取平均值。?OH清除率按公式（1）計算。

1.3.2.2 對O－2?的清除作用

采用鄰苯三酚自氧化法[15]進行測定。樣品凍干粉用超純水配成質(zhì)量濃度1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL樣品液。取3 mL 50 mmol/L pH 8.2的Tris-HCl緩沖液于試管中，加入不同質(zhì)量濃度樣品液1 mL，混勻，25 ℃恒溫10 min，然后加入25 ℃恒溫保存10 min的30 mmol/L的鄰苯三酚1 mL，反應5 min，加入HCl終止反應，320 nm波長處測定吸光度（A1），以超純水代替樣品溶液測定吸光度（A2）。O2－?清除率按公式（2）計算。

式中：A1為樣品吸光度；A2為空白吸光度。

1.3.2.3 對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基的清除作用

參照文獻[16]的方法略作修改。樣品用超純水配成質(zhì)量濃度1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL的溶液。在10 mL具塞試管中加入4 mL 0.1 mmol/L的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH，無水乙醇配制）溶液和1 mL無水乙醇，混勻，避光放置30 min后，以無水乙醇為參比，517 nm波長處測吸光度（A0）。在10 mL具塞試管中加入4 mL 0.1 mmol/L的DPPH溶液和1 mL待測樣品液，混勻，避光放置30 min，以無水乙醇作為參比，517 nm波長處測定吸光度（A1）。在10 mL具塞試管中加入4 mL無水乙醇和1 mL待測樣品溶液，混勻，避光放置30 min，以無水乙醇作參比，517 nm波長處測定吸光度（A2）。DPPH自由基清除率按公式（3）計算。

式中：A0為對照組吸光度；A1為粗肽樣品吸光度；A2為空白組吸光度。

1.3.3 膽酸鹽結(jié)合肽對血管內(nèi)皮細胞的影響

1.3.3.1 血管內(nèi)皮細胞原代與傳代培養(yǎng)

原代培養(yǎng)參考文獻[17-18]略作修改：取健康雄性SD大鼠一只，體質(zhì)量約200 g，斷頸處死，無菌條件下取出胸主動脈立即放入無菌磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）并轉(zhuǎn)移至無菌工作臺，用眼科鑷子小心去除血管外結(jié)締組織和脂肪，PBS沖洗血管管腔3～4 次，用眼科剪剪去細小血管分支，轉(zhuǎn)入另一個無菌培養(yǎng)皿中。縱向剪開血管并將其剪成約2 mm×2 mm大小的血管塊，血管塊內(nèi)皮向下轉(zhuǎn)入25 cm2培養(yǎng)瓶中，每個培養(yǎng)瓶放置10～15 個血管塊，加入適量DMEM培養(yǎng)液（20% FBS、青霉素100 U/mL、鏈霉素100 μg/mL）至剛好沒過血管塊為宜。培養(yǎng)瓶置37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)4 d，棄掉血管塊，并更換新的培養(yǎng)液，以后2～3 d換液一次。傳代培養(yǎng)：原代細胞培養(yǎng)12～14 d，約80%原代細胞融合時即可進行傳代培養(yǎng)。棄掉培養(yǎng)液，用PBS沖洗培養(yǎng)瓶2 次，加入0.25%的胰蛋白酶消化1 min，立即加入等體積含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)液終止消化，吸管輕輕吹打并混勻，轉(zhuǎn)至離心管，于1 000 r/min條件下離心5 min，棄上清液，加入適量新的DMEM培養(yǎng)液制成細胞懸液，按細胞數(shù)量1∶3進行傳代培養(yǎng)。

1.3.3.2 實驗處理及分組

選用3 代細胞，用培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為1.0×105個/mL，接種于24 孔板中，每孔1 mL，細胞生長至80%融合時，吸棄培養(yǎng)液，加入無血清培養(yǎng)液，待細胞同步生長后，再加入含樣品肽（無血清培養(yǎng)液溶解）的培養(yǎng)液，培養(yǎng)12、24、48 h，然后用0.4%臺盼藍進行細胞計數(shù)，用血球計數(shù)板計數(shù)藍染的死細胞數(shù)和拒染的活細胞數(shù)，細胞存活率按式（4）計算。

分組：將培養(yǎng)已融合的血管內(nèi)皮細胞分成4 組。空白對照組：不添加肽樣品；低劑量組：肽終質(zhì)量濃度0.20 mg/mL；中劑量組：肽終質(zhì)量濃度0.60 mg/mL；高劑量組：肽終質(zhì)量濃度1.0 mg/mL；各組重復3 個孔，分別培養(yǎng)6、12、24 h后吸取上清液，進行測定。

1.3.3.3 NO含量的測定

參照文獻[16]采用Griess試劑顯色法。吸取各組上清液100 ?L于96 孔板中，各加入100 ?L Griess試劑，30 ℃條件下反應10 min，用酶標儀540 nm波長處測定吸光度。各取100 ?L濃度分別為0、5、10、20、40、60 μmol/L NaNO2標準液于96 孔板中，各加入100 ?L Griess試劑，30 ℃反應10 min，測吸光度。以NaNO2濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線，回歸方程為y=0.006 8x+ 0.012 1，R2=0.993 1。

1.3.3.4 前列環(huán)素含量的測定

采用6-酮-前列腺素F1α試劑盒檢測，按指示步驟進行。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗重復3 次，采用Origin 8.6軟件處理，實驗數(shù)據(jù)以±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 膽酸鹽結(jié)合肽對化學抗氧化作用的影響

2.1.1 對?OH的清除作用

OH清除作用的影響Fig. 1 Scavenging effect of bile acid salt binding peptide on hydroxyl radicals圖1 膽酸鹽結(jié)合肽對·

由圖1可知，隨著樣品質(zhì)量濃度增加，其對?OH的清除率逐漸升高，相關(guān)性分析顯示清除率與處理質(zhì)量濃度顯著正相關(guān)（P＜0.05），當質(zhì)量濃度達到5 mg/mL時，膽酸鹽結(jié)合肽對?OH的清除率最高達88.7%。

2.1.2 對O2－?的清除作用

由圖2可知，樣品對O2－?的清除率隨樣品質(zhì)量濃度增加顯著增強，相關(guān)性分析顯示O2－?清除率與處理質(zhì)量濃度顯著正相關(guān)（P＜0.05），當質(zhì)量濃度達到5 mg/mL時，清除率最高達到72.7%。

的清除效果Fig. 2 Scavenging effect of bile acid salt binding peptide on superoxide anion radicals圖2 酸肉膽酸鹽結(jié)合肽對O－2?

2.1.3 對DPPH自由基的清除作用

圖3 酸肉膽酸鹽結(jié)合肽對DPPH自由基的清除效果Fig. 3 Scavenging effect of bile acid salt binding peptide on DPPH radicals

由圖3可知，隨著樣品質(zhì)量濃度升高，其對DPPH自由基清除效果逐漸增強，相關(guān)性分析顯示清除率與處理質(zhì)量濃度顯著正相關(guān)（P＜0.05），當達到5 mg/mL時最高，為78.3%。經(jīng)計算膽酸鹽結(jié)合肽對?OH、O－2?、DPPH

自由基的半清除濃度（half inhibitory concentration，IC50）分別為2.04、2.79、2.50 mg/mL，表明在相同質(zhì)量濃度下，樣品對?OH有更好的清除效果，其次是對DPPH自由基。

2.2 膽酸鹽結(jié)合肽對大鼠胸主動脈血管內(nèi)皮細胞的影響

2.2.1 內(nèi)皮細胞形態(tài)學觀察及對細胞存活率的影響

圖4 血管內(nèi)皮細胞形態(tài)(×100)Fig. 4 Morphology of cultured endothelial cells (× 100)

主動脈血管塊于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d后，于倒置顯微鏡下觀察可發(fā)現(xiàn)有少量細胞遷出并貼壁生長，細胞形狀呈短梭或多角形。培養(yǎng)12～14 d后，遷出生長的細胞覆蓋培養(yǎng)瓶面積2/3左右，可看到血管內(nèi)皮細胞典型的“鋪路石”樣特征（圖4）。加入含樣品肽的培養(yǎng)液培養(yǎng)12、24、48 h，以臺盼藍染色計算細胞存活率，結(jié)果如圖5所示，各組細胞存活率均在80%以上，說明在此質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，樣品肽對血管內(nèi)皮細胞不具有明顯毒性。

圖5 血管內(nèi)皮細胞存活率Fig. 5 Effect of bile acid salt binding peptide on viability of endothelial cells as a function of culture time

2.2.2 對血管內(nèi)皮細胞NO釋放的影響如圖6可知，隨著培養(yǎng)時間延長，血管內(nèi)皮細胞NO釋放增加，不同劑量樣品肽處理均能使血管內(nèi)皮細胞NO釋放增加。在不同培養(yǎng)時間條件下，各劑量組內(nèi)皮細胞NO釋放不存在顯著差異（P＞0.05）；相同培養(yǎng)時間條件下，高劑量組與空白組比較，細胞NO釋放量存在顯著性差異（P＜0.05）。說明樣品肽對血管內(nèi)皮細胞NO的釋放有一定促進作用。

2.2.3 對血管內(nèi)皮細胞前列環(huán)素的影響

含量Fig. 7 Effect of bile acid salt binding peptide on 6-keto-PG F1secretion as a function of culture time圖7 各劑量組細胞培養(yǎng)液中6-酮-前列腺素F1

由圖7可知，各劑量組樣品肽處理的血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)液中6-酮-前列腺素F1α含量均高于同時間條件下的空白組。低、中、高劑量組處理的內(nèi)皮細胞，其細胞培養(yǎng)液上清液中6-酮-前列腺素F1α含量分別在培養(yǎng)12、12、24 h時達峰值，與相應空白組比較存在極顯著差異（P＜0.01）。相同空白培養(yǎng)時間條件下，中、高劑量組中6-酮-前列腺素F1α含量與空白組比較差異顯著（P＜0.05）。說明樣品肽可促使血管內(nèi)皮細胞分泌前列環(huán)素。

3 討論與結(jié)論

通常采用清除自由基法、還原力法、金屬離子螯合力法及脂質(zhì)過氧化抑制能力來評價抗氧化肽體外抗氧化活性[19]。鑒于氧化產(chǎn)生的根本原因在于自由基過剩，自由基清除力可最直接反映肽的抗氧化能力[20]，因此本研究采用?OH、O2－?、DPPH自由基清除實驗以評價酸肉中膽酸鹽結(jié)合肽的抗氧化能力。實驗結(jié)果表明，膽酸鹽結(jié)合肽對?OH、O2－?、DPPH自由基具有一定的清除效果，且清除率與質(zhì)量濃度呈一定的劑量-效應關(guān)系。在5 mg/mL時，對3 種自由基的清除效果分別為88.7%、72.7%、78.3%，略高于相同質(zhì)量濃度的泰和烏骨雞活性肽[21]；高于花生活性肽對DPPH自由基的清除能力[22]；稍高于草魚蛋白源抗氧化肽對O2－?的清除能力[20]；與紅松松仁抗氧化肽對?OH、O2－?的清除能力相當[23]；低于大米活性肽[24]或螺旋藻抗氧化肽[25]對?OH、DDPH自由基的清除能力。這可能與原料蛋白和蛋白酶種類有關(guān)，因為抗氧化活性多取決于肽段的氨基酸序列、氨基酸側(cè)鏈基團、相對分子質(zhì)量大小和空間構(gòu)象[26-27]，同時所選取的清除能力方法，肽的分離方法也會造成結(jié)果的差異性。

在對大鼠胸主動脈血管內(nèi)皮細胞功能因子的影響研究發(fā)現(xiàn)，膽酸鹽結(jié)合肽對大鼠胸主動脈血管內(nèi)皮細胞不具有明顯毒性，對血管內(nèi)皮細胞的NO釋放有一定的促進作用，可促使血管內(nèi)皮細胞前列環(huán)素I2（prostaglandin I2，PGI2）的分泌，由于其不穩(wěn)定，其含量在本實驗中以其穩(wěn)定的代謝產(chǎn)物6-酮-前列腺素F1α表示。而研究已證實，NO是內(nèi)皮依賴性血管舒張因子，NO合成分泌減少，會致使動脈依賴性血管舒張功能障礙，引發(fā)動脈粥樣硬化的早期病變[28-29]；PGI2是強的血管舒張劑，具有抑制凝血和血栓形成的功效，同時還可保護細胞，調(diào)節(jié)膽固醇代謝等作用[30-31]。由此說明，酸肉膽酸鹽結(jié)合肽通過結(jié)合膽酸鹽以及清除自由基，達到降血脂及預防動脈粥樣硬化的效果。

綜上，酸肉膽酸鹽結(jié)合肽通過結(jié)合膽固醇、較好的抗氧化保護作用以及促進血管內(nèi)皮細胞對NO、PGI2等生物活性物質(zhì)的分泌，進而可能對動脈粥樣硬化、降低膽固醇具有一定功效，可為傳統(tǒng)發(fā)酵食品發(fā)酵酸肉的功能化及產(chǎn)業(yè)化開發(fā)提供參考。

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Chemical Antioxidant Effect of Bile Acid Salt Binding Peptide from Fermented Sour Meat and Its Effect on Rat Thoracic Aorta Endothelial Cells

WEI Cheng1, LI Chenglong1,2, ZHU Lijuan1, XIE Yueying1, ZHOU Caiqiong1,*
(1. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China; 2. Chongqing Beer Company, Chongqing 401555, China)

The chemical antioxidant effect of bile acid salt binding peptide (with molecular weights of 265? 1 400 D and peptide content of 75.7%) from fermented sour meat was studied as well as its influence on rat thoracic aorta endothelial cells. The results showed that the antioxidant activity of the bile acid salt binding peptide was enhanced with the increase in its concentration. The IC50for scavenging hydroxyl, superoxide anion and 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) free radicals were 2.04, 2.79 and 2.50 mg/mL, respectively, indicating that the peptide had better scavenging effect against hydroxyl radical. Cytotoxicity studies showed that in the concentration range used in this study, the peptide had no obvious toxicity on rat aortic endothelial cells and it could stimulate the release of NO and the secretion of 6-keto-prostaglandin F1α especially at high concentration in comparison with the blank control group. All these results showed that the bile acid salt binding peptide may be beneficial in the prevention of cardiovascular diseases through its antioxidant activity and its effects on vascular endothelial cells.

fermented sour meat; bile acid salt binding peptide; chemical antioxidant effect; vascular endothelial cell; prostacyclin

10.7506/spkx1002-6630-201711036

TS218

A

1002-6630（2017）11-0225-06引文格式：

2016-05-23

重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心能力提升項目（cstc2014pt-gc8001）

韋誠（1992—），男，碩士研究生，研究方向為食品化學與營養(yǎng)學。E-mail：648950178@qq.com

*通信作者：周才瓊（1964—），女，教授，博士，研究方向為食品營養(yǎng)化學。E-mail：zhoucaiqiong@swu.edu.cn