劉穎 姜黎 王江維 沈政偉

·實驗研究·

角膜交聯(lián)術對酶消化抑制作用的動物實驗研究

劉穎 姜黎 王江維 沈政偉

目的 通過觀察常規(guī)交聯(lián)術后兔眼角膜組織在酶溶液中的變化，評估交聯(lián)術對角膜耐酶性的影響。方法 實驗研究。將27只日本大耳白兔隨機分成3組(胃蛋白酶組、胰蛋白酶組、膠原蛋白酶組)，每組9只，雙眼均去上皮，核黃素-右旋糖酐溶液滴眼3min/次，持續(xù)30min，滴10次。隨機取一眼為實驗組，另一眼為對照組，實驗組兔眼用自研角膜交聯(lián)機照射30min，對照組不照射，照射過程中每3min雙眼都用右旋糖酐-核黃素溶液及眼表麻藥沖洗1次結膜表面，之后立即處死兔子取雙眼角膜，并置于配好的3種對應酶溶液中，每組隨機選3只觀察并記錄每組角膜完全消化的時間及過程。剩下18只兔的眼角膜隨機分成3組，每組6只，分別在消化的第1、3、6天隨機取出兩只兔子剩余的角膜組織作光鏡觀察(HE染色)。結果 每組角膜組織的溶解時間實驗組均長于對照組，其中胰蛋白酶組有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。從角膜形態(tài)變化來看，實驗組發(fā)生形變的過程均慢于對照組。從光鏡觀察(HE染色)的結果來看實驗組角膜組織發(fā)生裂解的速度亦明顯慢于對照組。結論 角膜交聯(lián)術能使角膜結構更加穩(wěn)定、牢固，從而增強其耐酶性。

角膜交聯(lián)術；酶；消化；抑制

[臨床眼科雜志，2017，25：165]

[J Clin Ophthalmol,2017,25:165]

紫外光核黃素角膜膠原交聯(lián)術(corneal collagen cross- linking, CXL)是近十余年來應用于臨床的新型角膜成形技術。其運用的是光氧化反應原理：當光敏劑核黃素(維生素B2)在角膜基質層達到飽和狀態(tài)后,在370 nm波長紫外光照射下，被激發(fā)到三線態(tài)，產生以單線態(tài)氧為主的活性氧自由基(reactive oxide species,ROS)，ROS處于不穩(wěn)定狀態(tài)，直到誘導角膜基質膠原纖維間形成新的共價鍵后才轉變?yōu)榉€(wěn)定形式，從而使角膜生物力學增強，結構變得更加穩(wěn)定、牢固。目前，CXL在臨床上主要應用于圓錐角膜、術后角膜擴張等疾病的治療，效果較好。

有研究顯示CXL在某些難治性角膜潰瘍的治療方面亦取得了可喜的成果[1-3]，但其作用機制尚未完全明確，原因之一可能是交聯(lián)后的角膜生物力學增強，角膜變厚、變硬，從而對酶解作用的抵抗能力增強。角膜中含有多種酶，當潰瘍發(fā)生時，酶的種類及數(shù)量增多，從而促進角膜溶解[4]。本實驗將從胃蛋白酶、胰蛋白酶及膠原蛋白酶這3種酶對交聯(lián)后的兔眼角膜的消化情況來驗證上述機制。

資料與方法

一、實驗動物

7周齡清潔級日本大耳白兔27只，排除眼部及全身疾病，雌雄不限，體重2 kg左右，購于武漢萬千佳興生物科技有限公司，合格證號：No.42010000000898。實驗動物的使用遵循國家科委頒布的《實驗動物管理條例》。

二、實驗試劑及配制

核黃素磷酸鈉注射液(益然，江西制藥有限責任公司)，右旋糖酐40葡萄糖注射液(四川科倫藥業(yè)股份有限公司)，胃蛋白酶、胰蛋白酶、膠原蛋白酶(MDL生物科技有限公司)，生理鹽水，PBS緩沖液，HCL(pH約為1.5)(廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院醫(yī)學實驗中心提供)。

核黃素-右旋糖酐溶液，將核黃素磷酸鈉注射液與右旋糖酐40葡萄糖注射液按1:4的比例混合均勻，現(xiàn)配現(xiàn)用；胃蛋白酶溶液，取1 g胃蛋白酶溶于10 ml HCL溶液中，現(xiàn)配現(xiàn)用；胰蛋白酶溶液，取1g胰蛋白酶溶于10ml PBS緩沖液中，現(xiàn)配現(xiàn)用；膠原蛋白酶溶液：取1 g膠原蛋白酶溶于50 ml PBS緩沖液中，分成5等份，放入-40 ℃冷凍室內儲存，用之前取出室溫融化。

三、實驗儀器

自研角膜交聯(lián)機(華中科技大學光學與電子信息學院研制)[5](圖1),手術器械(廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院眼科準分子激光中心提供),Leica光學顯微鏡(廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院醫(yī)學實驗中心提供)。

圖1 自研角膜交聯(lián)機

四、方法

首先將27只日本大耳白兔按照酶的種類(胃蛋白酶、胰蛋白酶及膠原蛋白酶)隨機分成3組(每組9只)，用10%水合氯醛溶液進行全身麻醉(2.5 ml/kg),待兔子麻醉后，去除雙眼角膜中央直徑為9 mm區(qū)域的上皮，將配好的右旋糖酐-核黃素溶液滴加到角膜表面，3 min/次，持續(xù)30 min，滴10次。隨機取一眼為實驗組，再用角膜交聯(lián)機對實驗組眼睛照射30 min(波長為370±5 nm，功率為3 mW/cm2)，照射時注意保持光源對準角膜中央，兔眼與透鏡的距離在45 mm以內。在照射過程中，每3 min雙眼都用右旋糖酐-核黃素溶液及眼表麻藥沖洗一次結膜表面。照射結束后，立即用空氣栓塞法將兔子處死取雙眼角膜(胰蛋白酶組隨機選3只兔的眼角膜放入沸水中加熱10 min，用于觀察角膜組織消化天數(shù))，泡入配好的酶溶液中，并置于酶的最適溫度，觀察。除胰蛋白酶組外，胃蛋白酶組及膠原蛋白酶組也隨機取3只兔的角膜不做處理，觀察其形態(tài)變化直到組織被完全消化，并記錄消化完成時間；每組剩余6只兔的角膜剩余組織在術后第1、3、6天各隨機選2只取出切片，再進行光鏡(HE染色)觀察。

五、統(tǒng)計學方法

數(shù)據用SPSS16.0統(tǒng)計學軟件進行分析，采用獨立樣本t檢驗對每組中實驗組和對照組角膜消化時間進行數(shù)據分析，P<0.05為有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、兔眼角膜組織完全消化時間

3組兔眼角膜交聯(lián)術均順利完成。胃蛋白酶組：角膜消化時間實驗組分別為66d、65d、59d，平均(63.33±2.19)d；對照組分別為61d、59d、52d，平均(57.33±2.73)d，實驗組長于對照組，差異無統(tǒng)計學意義(t=1.72,P=0.16)。胰蛋白酶組：角膜消化時間實驗組分別為4d、4d、4d，平均4.00d；對照組分別為3d、3d、2d，平均為(2.67±0.33)d，實驗組明顯長于對照組(t=4.00,P=0.02)。膠原蛋白酶組：角膜消化時間實驗組分別為7d、3d、5d，平均(5±1.15)d；對照組分別為2d、2d、2d，平均2.00d，實驗組長于對照組，差異無統(tǒng)計學意義(t=1.73,P=0.16)(表1)。

圖9 光鏡下胰蛋白酶1d對照組(HE×200) 圖10 光鏡下胰蛋白酶3d實驗組(HE×200) 圖11 光鏡下胰蛋白酶3d對照組(HE×200) 圖12 光鏡下胰蛋白酶6d實驗組(HE×200) 圖13 光鏡下胰蛋白酶6d對照組(HE×200) 圖14 光鏡下膠原蛋白酶1d實驗組(HE×200) 圖15 光鏡下膠原蛋白酶1d對照組(HE×200) 圖16 光鏡下膠原蛋白酶3d實驗組(HE×200) 圖17 光鏡下膠原蛋白酶3d對照組(HE×200) 圖18 光鏡下膠原蛋白酶6d實驗組(HE×200) 圖19 光鏡下膠原蛋白酶6d對照組(HE×200)

表1 各組角膜完全消化的時間(d)

二、兔眼角膜消化過程形態(tài)變化

角膜放入胃蛋白酶溶液后，在最初的十幾天里逐漸皺縮、變薄，20d左右時出現(xiàn)裂孔，繼而破裂成絲狀最后消失，實驗組變化均明顯慢于對照組。胰蛋白酶組的角膜經沸水浴后明顯腫脹，在溶液中1d即可轉變?yōu)樗槟睿?d左右消失，實驗組的變化稍慢于對照組。膠原酶組實驗組變化稍慢，在最初幾天還能觀察到完整角膜組織，而對照組角膜組織在酶溶液中很快裂解，然后消失。

三、兔眼角膜的光鏡(HE染色)結果

胃蛋白酶組：消化1d后取出的角膜組織示，實驗組角膜膠原纖維較腫脹，排列較稀疏，中外1/3層膠原染色顏色明顯深于內層，細胞稍腫脹，胞核清晰可見；對照組角膜膠原纖維排列疏松，間距明顯增寬，染色較均勻，細胞腫脹，未見明顯細胞核。實驗組較對照組膠原纖維間距明顯要小，排列也更為致密(圖2,3)。第3天時，實驗組角膜膠原纖維腫脹較嚴重，細胞核形態(tài)變大，密度降低；對照組角膜膠原纖維明顯腫脹，間距消失。實驗組較對照組纖維排列更為致密(圖4,5)。消化6d后組織染色示，與前兩次比較，兩組膠原纖維排列更為稀疏，膠原顏色均明顯變淺，實驗組較對照組深(圖6,7)。

胰蛋白酶組：消化1d時，實驗組及對照組組織著色較深，纖維間隙增寬，均可見胞質變性，胞核腫脹及空泡變性，對照組較實驗組變化更明顯，實驗組炎細胞侵潤更甚(圖8,9)。隨著觀察時間變化，組織著色逐漸變淺，膠原纖維間距逐漸增寬，胞核逐漸減少，且對照組較實驗組變化更為明顯(圖10～13)。

膠原蛋白酶組：消化1d后取出的角膜組織示，實驗組膠原纖維間距明顯增大，胞核清晰可見；對照組膠原纖維間距增大，但小于實驗組，腫脹較實驗組更重，胞核可見(圖14,15)。消化3d后的角膜組織示，膠原纖維間距較之前明顯增大，細胞核減少，密度降低，實驗組纖維組織較對照組排列更整齊、致密(圖16,17)。第6天組織示，兩組染色均變淺，膠原排列稀疏(圖18,19)。

討 論

據WHO數(shù)據，角膜病已成為全球第四大致盲疾病，約占5.1%，并且其中有一部分人是可以通過角膜移植手術重獲光明的。就目前我國眼庫(eyebank)現(xiàn)狀來看，角膜移植術情況不容樂觀，因此找到能夠阻止角膜病的進展甚至替代角膜移植術的手段就顯得尤為重要。

正常人眼角膜的細胞外基質大部分為膠原纖維，當角膜發(fā)生炎癥時，不僅微生物，宿主中的各種細胞也能合成和分泌多種酶類，從而對組織產生破壞，其中已經明確的有膠原酶及多種蛋白酶[6]。有研究表明，上皮能調節(jié)角膜細胞分泌膠原酶，并將角膜或多形核細胞釋放的潛酶激活，同時受傷的上皮還能釋放促炎性反應因子，使多形核細胞的數(shù)量變多，從而導致了角膜基質潰瘍的產生[7]。胰蛋白酶能夠將蛋白質分解，并且專一地從蛋白質上除去帶正電荷的氨基酸，從而使組織細胞排列松散[8]，現(xiàn)已成為體外消化、培養(yǎng)角膜內皮細胞的重要試劑之一。因此本實驗選擇胃蛋白酶、胰蛋白酶及膠原酶來消化角膜組織。通過兔眼角膜組織被完全消化的時間可以看出經過交聯(lián)后的兔眼角膜的消化時間均長于未交聯(lián)角膜，且胰蛋白酶組有統(tǒng)計學意義，另兩組可能是由于樣本數(shù)量過少，后續(xù)將擴大樣本量再展開進一步試驗。Spoerl等[9]使用豬眼角膜分別在上述三種酶作用下，結果交聯(lián)角膜在第13、14、5天時被溶解，未交聯(lián)角膜分別在第6、6、2天時溶解，交聯(lián)角膜溶解時間均長于對照組，這與本研究結果一致。從肉眼觀察的角膜形態(tài)變化來看，對照組發(fā)生皺縮、變薄、裂孔甚至破碎的速度均較實驗組更慢。

光鏡結果則更為形象、明確，隨著角膜組織在酶溶液中逐漸被消化，纖維間距逐漸增寬，膠原染色逐漸變淺。各組角膜組織在不同的時間點均可觀察到實驗組較對照組組織排列更為致密，著色也更深，說明實驗組的消化速度較對照組要更慢。胃蛋白酶組在消化1天后取出的角膜組織染色示，中外1/3層顏色明顯深于內層，與之前研究的交聯(lián)角膜的基質層300μm處有明顯分界限的結果一致[10]。這都說明交聯(lián)術能增強角膜組織的生物力學特性，使其結構更加牢固穩(wěn)定，從而提高了角膜抵抗酶消化作用的能力。

目前，國內外很多研究都證實交聯(lián)術可增強角膜的機械強度[11]，但抗酶解力的相關研究并不多，其具體作用機制更有待進一步研究。本實驗初步驗證了角膜交聯(lián)術對抗酶解作用的效果，后續(xù)將擴大樣本量及檢測方法進行更為豐富系統(tǒng)的研究，以期能有更多的收獲，從而更加了解角膜交聯(lián)術，未來能更好的為角膜病患提供幫助。

[1]KanellopoulosAJ.Novelmyopicrefractivecorrectionwithtransepithelialveryhigh-fluencecollagencross-linkingappliedinacustomizedpattern:earlyresultsofafeasibilitystudy.ClinOphthalmol,2014,8:697-702.

[2]EhlersN,HjortdalJ,NielsenK,etal.Riboflavin-UVAtreatmentinthemanagementofedemaandnonhealingulcersofthecornea.JRefractSurg,2009,25:803-806.

[3]IseliHP,ThielMA,HafeziF,etal.UltravioletA/riboflavincornealcross-linkingforinfectiouskeratitisassociatedwithcornealmelts.Cornea,2008,27:590-594.

[4] 李婧，姜黎，沈政偉.角膜交聯(lián)術新進展及臨床運用.國際眼科雜志，2010，10:1713-1715.

[5] 史明坤，胡兵，應花山，等.應用于角膜膠原交聯(lián)術的紫外LED照射儀的設計.醫(yī)療衛(wèi)生裝備,2015，36:19-22.

[6] 李瑩，謝立信.角膜理論基礎及臨床實踐.天津：天津科技翻譯出版公司，2007,246-247.

[7]ShinomiyaK,UetaM,SotozonoC,etal.ImmunohistochemicalanalysisofinflammatorylimbalconjunctivaadjacenttoMooren’sulcer.BrJOphthalmol,2013，97:362-366.

[8]FreshneyR.I.AnimalCellCulture,aPracticalapproach.OxfordUniversityPress,1992,10.

[9]EberhardSpoerl,GregorWollensak,TheoSeiler.Increasedresistanceofcrosslinkedcorneaagainstenzymaticdigestion.CurrentEyeResearch,2004,29:35-40.

[10]SeilerT,HafeziF.Corneacross-linking-inducedstromaldemarcationline.Cornea,2006,25:1057-1059.

[11] 李剛.核黃素-紫外線A膠原交聯(lián)對角膜膠原纖維重塑及生物力學穩(wěn)定性的影響.北京:軍醫(yī)進修學院，2012.

(收稿：2016-08-22)

Rabbit corneal tissue resistant to in vitro enzymatic digestion after corneal collagen cross-linking

LiuYing,JiangLi,WangJiangwei,ShenZhengwei.

DepartmentofOphthalmology,WuhanGeneralHospitalofGuangzhouMilitaryRegion,Wuhan,Hubei430070,China

Objective To assess the effects of corneal cross-linking in rabbit cornea on its resistance to in vitro enzymatic digestion. Methods Twenty-seven Japanese white rabbits were randomly divided into three groups to be treated with different enzymes (pepsin, trypsin, collagenase). Each group had nine rabbits. Rabbit corneal epithelium was scraped. Riboflavin-dextran solution was topically administrated every three minutes for half an hour1(i.e, 10 times in total). Then one eye (randomly selected for each animal) was exposed to UV-LED irradiator for 30 minutes. Both eyes were rinsed by dextran-riboflavin and ocular surface anesthetic every 3 minutes during irradiation. Corneas were immediately taken after the rabbits were sacrificed and placed in different enzyme solutions. Time and process until the corneas had been completely digested were recorded. Another 18 Japanese white rabbits served as control. Corneal tissues were put into enzyme solutions without pre-treatment with UV-LED irradiation. Results It took more time to completely digest the cornea tissue from experimental animals, especially by Trypsin (P<0.05).Cornealdeformationoccurssignificantlyslower.Lightmicroscopyhistologyshowedthatthecleavagerateofexperimentalcornealtissuewassignificantlyslower. Conclusions Corneal cross-linking makes cornea’s structure more stable and firmer, thereby enhancing its resistance to enzymatic digestion.

Corneal collagen cross-linking; Enzyme; Digestion; Resistance

10.3969/j.issn.1006-8422.2017.02.021

武漢市科技攻關計劃(No.201161038346)

430070 武漢，廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院眼科

沈政偉(Email:sheneye@qq.com)