王四海,梁春利,張海紅,王樹(shù)△
大黃酚對(duì)腦缺血/再灌注小鼠腦組織NO的影響和斷頭抗缺氧作用
王四海1,梁春利1,張海紅2,王樹(shù)2△
目的研究大黃酚(Chry)對(duì)小鼠腦缺血/再灌注損傷后腦組織內(nèi)NO的影響及其斷頭抗缺氧作用。方法將75只SPF級(jí)昆明種小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、大黃酚高劑量組(Chry 10.0 mg/kg)、中劑量組(Chry 1.0 mg/kg)、低劑量組(Chry 0.1 mg/kg)。采用改良Himori法制作小鼠腦缺血/再灌注損傷模型,根據(jù)Bederson評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定小鼠神經(jīng)功能損傷評(píng)分。對(duì)各組小鼠進(jìn)行斷頭抗缺氧實(shí)驗(yàn),記錄小鼠喘息時(shí)間,并測(cè)定腦組織內(nèi)NO的含量。結(jié)果與模型組比較,大黃酚低、中、高劑量組腦缺血再灌注后神經(jīng)功能損傷評(píng)分和腦組織NO含量明顯降低,斷頭抗缺氧的喘息時(shí)間(s)明顯延長(zhǎng)[低劑量組,14.6±1.2;中劑量組,16.4±1.2;高劑量組,17.4±1.1;與模型組(13.2±1.0)比較,均P<0.05]。結(jié)論大黃酚可通過(guò)減少腦內(nèi)NO含量和抗缺氧作用對(duì)腦缺血/再灌注損傷起到保護(hù)效應(yīng)。
大黃酚;腦缺血;再灌注損傷;一氧化氮;抗缺氧;Himori法
大黃酚(chrysophanol,Chry)是大黃中游離型蒽醌類成分之一,具有廣泛的生物活性,如抗心肌缺血、改善脂肪代謝、抗炎、利尿、抗癌、止咳和神經(jīng)保護(hù)作用等。本課題組前期研究證實(shí),在小鼠腦缺血/再灌注損傷引起的記憶功能障礙中,大黃酚呈現(xiàn)出明顯的神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)[1]。另有研究顯示,腦缺血小鼠由于亞硝酸鈉(NaNO2)中毒可導(dǎo)致耐缺氧能力減弱,而大黃酚能提高小鼠腦組織的耐缺氧能力,明顯延長(zhǎng)小鼠存活時(shí)間[2]。一氧化氮(NO)在腦缺血/再灌注損傷中的作用機(jī)制十分復(fù)雜,既可以緩解組織缺血、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞受到損傷,又可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)揮神經(jīng)細(xì)胞毒性作用[3-4]。目前有關(guān)大黃酚對(duì)腦組織中NO的影響及其斷頭抗缺氧作用尚少見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)改良后的Himori法制作小鼠腦缺血/再灌注損傷實(shí)驗(yàn)?zāi)P停芯看簏S酚對(duì)腦組織中NO的影響及其斷頭抗缺氧作用,為臨床治療腦血管疾病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
1.1 材料
1.1.1 主要試劑及儀器 大黃酚購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所(批號(hào) 110796-200412,純度≥98%),按照 N,N-二甲基甲酰胺∶聚山梨酯-80∶生理鹽水為1∶1∶8的比例配制溶劑,溶解大黃酚,用生理鹽水稀釋至質(zhì)量濃度(W/V)為0.1%、0.01%、0.001%備用。NO試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。LabTech全自動(dòng)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京萊伯泰科儀器有限公司);FSH-2內(nèi)切式組織可調(diào)高速勻漿器(江蘇大地自動(dòng)化儀器廠);二列六孔電熱恒溫水浴鍋(北京精科華瑞儀器有限公司);Sigma3K30高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司);Forma-86c ULT冰柜(-80℃,美國(guó)熱電公司)。
1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 75只昆明種小鼠,SPF級(jí),雌雄不限,體質(zhì)量(28±2)g,許可證編號(hào):SYXK(京)2009-0004,購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所。采用隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠分為5組(n=15):假手術(shù)組正常手術(shù),但不進(jìn)行腦缺血/再灌注操作;模型組和大黃酚低、中、高劑量組均進(jìn)行腦缺血/再灌注操作,大黃酚低、中、高劑量組分別于缺血前30 min腹腔注射大黃酚0.1、1.0、10.0 mg/kg;假手術(shù)組和模型組分別在缺血前30 min腹腔注射配制溶劑10 mL/kg。
1.2 方法
1.2.1 小鼠腦缺血/再灌注損傷模型的制備 通過(guò)改良Himori法[5]造模。腹腔注射 3.5%水合氯醛(10 mL/kg)麻醉小鼠后,以仰臥位形式固定,在頸部正中縱向切開(kāi)約6 mm切口,找出兩側(cè)頸總動(dòng)脈并進(jìn)行分離,用黑色手術(shù)線(手術(shù)線提前用液體石蠟浸泡)穿過(guò)兩側(cè)的頸總動(dòng)脈,盡量將兩側(cè)頸總動(dòng)脈恢復(fù)到原位,而后輕柔地將黑色手術(shù)線打成松的反手結(jié)(在氣管上方),反手結(jié)的松緊程度不應(yīng)壓迫氣管。在兩側(cè)頸總動(dòng)脈的上方黑線上,穿過(guò)1條白色手術(shù)線(手術(shù)線提前用液體石蠟浸泡),根據(jù)Himori方法埋好線后將切口縫合。在手術(shù)后48 h,拉緊頸下部黑色手術(shù)線,使得兩側(cè)頸總動(dòng)脈阻斷,造成大腦缺血,5 min后慢而輕地拉兩側(cè)的白色手術(shù)線,在頸總動(dòng)脈中恢復(fù)血液再灌注。
根據(jù)Bederson評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)各組小鼠神經(jīng)功能損傷情況進(jìn)行評(píng)分:0分,無(wú)神經(jīng)損傷;1分,懸尾試驗(yàn)不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪;2分,前肢抵抗對(duì)側(cè)推力下降;3分,向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈。
1.2.2 斷頭抗缺氧實(shí)驗(yàn)和腦組織內(nèi)NO含量的測(cè)定 假手術(shù)組正常手術(shù),但不作腦缺血/再灌注操作;模型組和大黃酚組均在手術(shù)后的48 h將血流阻斷5 min,血供恢復(fù)后10 min將小鼠快速斷頭處死[6],觀察小鼠張口喘息情況,以5 s內(nèi)不再?gòu)埧诖⒆鳛橛^察指標(biāo),記錄小鼠喘息時(shí)間。
在冰塊生理鹽水上將顱骨快速打開(kāi),取出腦,將腦膜及小腦除去,大腦部分保留,用4℃生理鹽水沖洗后,用小濾紙片吸干,放置在1 mL離心管中,然后置于Forma-86C ULT冰柜中進(jìn)行冷凍貯存。當(dāng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí),把冷凍的腦組織取出并制成體積分?jǐn)?shù)為10%的腦組織勻漿,以3 500~4 000 r/min于低溫離心機(jī)(-4℃)進(jìn)行離心,10 min后取出離心管,將適量上清液取出,以NO試劑盒測(cè)定腦組織內(nèi)NO含量。組織勻漿中NO含量(μmol/L)=[(測(cè)定管吸光度-空白管吸光度)/(標(biāo)準(zhǔn)管吸光度-空白管吸光度)]×標(biāo)準(zhǔn)管濃度(20 μmol/L)。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析,組間多重比較行LSD-t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 腦缺血/再灌注后小鼠神經(jīng)功能損傷評(píng)分 模型組小鼠腦缺血/再灌注后神經(jīng)功能損傷嚴(yán)重,其神經(jīng)功能損傷評(píng)分(2.90±0.32)明顯高于假手術(shù)組(0.10±0.02),大黃酚低、中、高劑量組神經(jīng)功能損傷評(píng)分[分別為(2.40±0.70)、(1.89±0.60)、(1.36±0.50)]均低于模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=82.31,n=15,P<0.05)。
2.2 大黃酚對(duì)小鼠腦缺血/再灌注斷頭后抗缺氧的喘息時(shí)間影響 與假手術(shù)組比較,模型組小鼠腦缺血/再灌注斷頭后抗缺氧的喘息時(shí)間顯著縮短(P<0.05);與模型組比較,大黃酚低、中、高劑量組小鼠腦缺血/再灌注斷頭后抗缺氧的喘息時(shí)間顯著增加(均 P<0.05),見(jiàn)表 1。
2.3 大黃酚對(duì)小鼠腦缺血/再灌注腦組織中NO含量的影響 與假手術(shù)組比較,模型組小鼠腦組織中NO含量顯著增加(P<0.05);與模型組比較,大黃酚低、中、高劑量組小鼠腦缺血/再灌注腦組織中NO含量顯著減少(P<0.05),見(jiàn)表1。
Tab.1 Effects of chrysophanol on NO in brain tissue and gasping time after cerebral ischemia-reperfusion in mice表1 大黃酚對(duì)小鼠腦缺血/再灌注斷頭后抗缺氧的喘息時(shí)間及腦組織中NO含量的影響 (n=15,±s)
Tab.1 Effects of chrysophanol on NO in brain tissue and gasping time after cerebral ischemia-reperfusion in mice表1 大黃酚對(duì)小鼠腦缺血/再灌注斷頭后抗缺氧的喘息時(shí)間及腦組織中NO含量的影響 (n=15,±s)
**P<0.01;a與假手術(shù)組比較,b與模型組比較,P<0.05
假手術(shù)組模型組大黃酚低劑量組大黃酚中劑量組大黃酚高劑量組F 20.6±1.7 13.2±1.0a14.6±1.2b16.4±1.2b17.4±1.1b43.26**2.5±1.4 5.5±3.0a4.0±1.5b1.5±0.9b2.2±1.5b94.23**
本研究結(jié)果表明,腦缺血/再灌注模型小鼠腦組織中NO含量顯著增加,這與文獻(xiàn)報(bào)道相一致[3-4],在腦缺血/再灌注損傷中,當(dāng)神經(jīng)元產(chǎn)生的NO持續(xù)增加,產(chǎn)生過(guò)氧化硝基物和過(guò)氧化陰離子導(dǎo)致神經(jīng)毒性,可造成神經(jīng)細(xì)胞的損傷。另外,本研究結(jié)果顯示,與模型組比較,大黃酚低、中、高劑量組小鼠腦缺血/再灌注腦組織中NO含量顯著減少,提示大黃酚對(duì)小鼠腦缺血/再灌注腦組織中NO含量呈現(xiàn)出顯著的抑制效應(yīng)。氧自由基(oxygen free radical,OFR)生成增多和脂質(zhì)過(guò)氧化的發(fā)生是腦缺血/再灌注損傷發(fā)病的重要機(jī)制,氧自由基的生成對(duì)血腦屏障造成很大損傷,加速腦水腫形成、引起血管內(nèi)皮黏附分子(VECAM)的表達(dá)以及血小板和白細(xì)胞與內(nèi)皮的黏附,使得腦缺血/再灌注后腦部的微血管循環(huán)障礙加重;同時(shí),隨著腦缺血/再灌注的發(fā)展,自由基劇烈增多,導(dǎo)致生物膜不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng),使細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生損傷,引起細(xì)胞膜功能障礙[7]。因此抗自由基損傷是防治腦缺血/再灌注損傷的重要機(jī)制之一。NO是自由基損傷的主要標(biāo)志物之一。由此提示大黃酚可減少腦中NO的含量,清除缺血/再灌注損傷小鼠腦中的自由基,保護(hù)大腦功能,是其保護(hù)腦缺血/再灌注損傷的重要機(jī)制之一。
本研究中斷頭抗缺氧實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與假手術(shù)組比較,模型組小鼠斷頭后抗缺氧的喘息時(shí)間顯著縮短;與模型組比較,大黃酚可明顯延長(zhǎng)腦缺血/再灌注小鼠抗缺氧的喘息時(shí)間,提示小鼠腦缺血/再灌注后急性抗缺氧能力降低,大黃酚能顯著提高小鼠急性抗缺氧的能力。有研究報(bào)道,苯腎上腺素(phenylephrine)可誘導(dǎo)豚鼠胸主動(dòng)脈環(huán)血管發(fā)生收縮反應(yīng),而大黃酚能抑制該收縮效應(yīng),呈劑量依賴性;另外,大黃酚還可抑制組胺和氯化鉀誘導(dǎo)的血管收縮效應(yīng),分別可降低最大收縮力19.2%和18.8%,表明大黃酚有舒血管的效應(yīng),能使血流量增加,從而提高血氧水平[8]。結(jié)合本研究,給予小鼠大黃酚后,小鼠的抗缺氧能力明顯增高,提示大黃酚通過(guò)舒張小鼠的血管,增加了血流量和血中的氧含量,從而增強(qiáng)了小鼠的抗缺氧能力。由此可推測(cè),大黃酚對(duì)腦缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用與其擴(kuò)張血管作用有關(guān),詳實(shí)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。
[1]趙薇,王樹(shù),李方江.大黃酚對(duì)小鼠腦缺血/再灌注腦組織抗氧化應(yīng)激和 AQP4 的影響[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2015,31(10):101477-101478.Zhao W,Wang S,Li FJ.Effects of chrysophanol on antioxidative stress and AQP4 in brain tissue of mice induced by cerebral ischemia-reperfusion injury[J].Chin Pharmacol Bull,2015,31(10):101477-101478.doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2015.10.030.
[2]顏娟,張丹參.大黃酚神經(jīng)保護(hù)作用及其機(jī)制研究進(jìn)展[J].神經(jīng)藥理學(xué)報(bào),2012,6(2):52-57.Yan J,Zhang DS.Protective effects and mechanisms of chrysophanol in the nervous system[J].Acta Neuropharm,2012,6(2):52-57.
[3]闞亮,張萌,何平.α-硫辛酸對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷氧化應(yīng)激影響[J].臨床軍醫(yī)雜志,2016,44(6):597-600.Kan L,Zhang M,He P.Effects of α-lipoic acid injection on oxidative stress in rats after cerebral ischemia reperfusion[J].Clin J Med Offic,2016,44(6):597-600.doi:10.16680/j.1671-3826.2016.06.13.
[4]曲園,付丹陽(yáng),紀(jì)影實(shí).丹參磷脂浸膏對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制[J].吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2015,41(2):291-295.Qu Y,F(xiàn)u DY,Ji YS.Protective effect of Danshenlinzhi on cerebral ischemia reperfusion injury in rats and its mechanism[J].Journal of Jilin University(Medicine Edition),2015,41(2):291-295.doi:10.13841/j.1671-587x.2015.02.16.
[5]趙薇,李方江,王樹(shù).大黃酚對(duì)小鼠腦缺血再灌注引起肝損傷的保護(hù)作用[J].神經(jīng)藥理學(xué)報(bào),2014,4(4):1-9.Zhao W,Li FJ,Wang S.Protective effects of chrysophanol on liver injury induced by cerebral ischemia-reperfusion in mice[J].Acta Neuropharm,2014,4(4):1-9.doi:10.3969/j.issn.2095-1396.2014.04.001.
[6]王樹(shù),張力,薛貴平.大黃素對(duì)腦缺血再灌注小鼠記憶功能的保護(hù)作用[J].神經(jīng)藥理學(xué)報(bào),2011,1(6):1-6.Wang S,Zhang L,Xue GP.Protective effects of emodin on the memory of mice experiencing cerebral ischemia reperfusion[J].Acta Neuropharm,2011,1(6):1-6.
[7]王四海,郭楨,張秀敏,等.清除自由基對(duì)腦缺血損傷的保護(hù)作用[J].河北北方學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2014,30(5):107-109.Wang SH,Guo Z,Zhang XM,et al.Protective effects of scavenging free radical in cerebral ischemia injury[J].Journal of Hebei North University(Natural Science Edition),2014,30(5):107-109.doi:10.3969/j.issn.1673-1492.2014.05.039.
[8]孫曉如,周新新,朱荔,等.中藥羊蹄抑制激動(dòng)劑誘導(dǎo)血管收縮活性成分的分離及藥理活性的研究[J].南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),1999,19(6):488-490.Sun XR,Zhou XX,Zhu L,et al.Influence of different active components of Rumex japonicas Hott on agonistinduced contraction of thoracic aorta[J].Acta Universitatis Medicinalis Nanjing,1999,19(6):488-490.
(2017-01-18收稿 2017-04-12修回)
(本文編輯 陳麗潔)
Effects of chrysophanol on NO of brain tissue and anti-anoxia in mice with cerebral ischemia-reperfusion injury
WANG Si-hai1,LIANG Chun-li1,ZHANG Hai-hong2,WANG Shu2△
1 Department of Cardiothoracic Surgery,the Second Affiliated Hospital of Hebei North University,Xuanhua 075100,China;2 Department of Pharmacy,Hebei North University△
E-mail:wangshu388@163.com
ObjectiveTo study the effects of chrysophanol(Chry)on NO of brain tissue and anti-anoxia in mice with cerebral ischemia-reperfusion injury.MethodsA total of 75 SPF Kunming mice were randomly allocated into five groups:sham operation group,ischemia-reperfusion group,high-dose group(Chry 10.0 mg·kg-1),medium-dose group(Chry 1.0 mg·kg-1)and low-dose group(Chry 0.1 mg·kg-1).Using improved Himori method,cerebral ischemia reperfusion-injury model was produced in conscious mice by temporarily obstructing bilateral common carotid arteries.The neurological function was measured according to the Bederson scoring standard.The mice were subjected to decapitation for hypoxia tolerance test.The gasping time was measured by anoxia tolerance test in beheaded mice.The level of NO in cerebrum was detected.ResultsChrysophanol can decrease the level of NO in cerebrum of mice with cerebral ischemia-reperfusion injury and prolong the gasping time in beheaded mice with cerebral ischemia-reperfusion injury[low-dose group,(14.6±1.2)s;medium-dose group,(16.4±1.2)s;high-dose group,(17.4±1.1)s;ischemia-reperfusion group,(13.2±1.0)s,P<0.05].ConclusionThe protective effects of chrysophanol on cerebral ischemia-reperfusion injury are involved in decreasing the content of NO in brain tissue and anti-anoxia in mice.
Chrysophanol;brain ischemia;reperfusion injury;nitric oxide;anti-anoxia;Himori method
R285.5
:A
10.11958/20170078
河北省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(07276166);河北北方學(xué)院自然科學(xué)研究項(xiàng)目(2010022)
1河北北方學(xué)院第二附屬醫(yī)院心胸外科(郵編075100);2河北北方學(xué)院藥學(xué)系
王四海(1970),男,碩士研究生,副主任醫(yī)師,主要從事多器官損傷保護(hù)研究
△通訊作者 E-mail:wangshu388@163.com