李揚(yáng)娜，曾紅梅,周 璐,馬麗娜，王思翔

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，南昌 330006)

亞甲基四氫葉酸還原酶C677T基因多態(tài)性、血漿同型半胱氨酸水平與遺忘型輕度認(rèn)知功能障礙的關(guān)系

李揚(yáng)娜，曾紅梅,周 璐,馬麗娜，王思翔

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，南昌 330006)

目的 探討亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)C677T基因多態(tài)性及血漿同型半胱氨酸(Hcy)水平與遺忘型輕度認(rèn)知功能障礙(aMCI)的相關(guān)性。方法 取65例aMCI患者(aMCI組)、61例阿爾茨海默病(AD)患者(AD組)和63例同期體檢健康的老年人(對照組)為研究對象，采用酶聯(lián)免疫法測定血漿Hcy濃度，應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)檢測MTHFR C677T基因型。結(jié)果 aMCI組及AD組Hcy濃度高于對照組(P<0.05);aMCI組及AD組的MTHFR基因的TT基因型、T等位基因分布頻率明顯高于對照組(P<0.05)；aMCI組和AD組CT或TT基因型者，尤其TT型，血漿Hcy水平均明顯高于無基因突變者即CC型(P<0.001)。結(jié)論 MTHFR基因C677T突變及高水平Hcy與認(rèn)知功能損害的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，高Hcy血癥是aMCI及AD發(fā)病的一個(gè)重要危險(xiǎn)因素。

遺忘型輕度認(rèn)知功能障礙；阿爾茨海默?。换蚨鄳B(tài)性；亞甲基四氫葉酸還原酶；血漿同型半胱氨酸；老年人

阿爾茨海默病(AD)是一種進(jìn)行性神經(jīng)變性疾病，而輕度認(rèn)知功能障礙(MCI))是介于正常衰老與癡呆的一種中間狀態(tài)，由于MCI向AD轉(zhuǎn)化率高而倍受研究者關(guān)注。遺忘型輕度認(rèn)知功能障礙(aMCI)主要以情景記憶損害為突出表現(xiàn)，在MCI所有類型中，以aMCI向AD轉(zhuǎn)化率最高[1-2]。近年來有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)高同型半胱氨酸血癥(HHcy)是AD的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一[3]，Hcy代謝的限速酶亞甲基四氫葉酸還原酶MTHFR的C677T堿基突變會(huì)減弱其自身的活性，而導(dǎo)致HHcy[4]。鑒于此，本文分析MTHFR的C677T基因突變及HHcy與aMCI的關(guān)系，旨在探討這兩者對aMCI的影響。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2015年6月至2017年1月在南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科門診及住院部治療的患者共126例，均參照美國精神病學(xué)會(huì)制定的《精神病的診斷和統(tǒng)計(jì)手冊(DSM-IV)》進(jìn)行診斷。其中：aMCI患者65例(aMCI組)，男29例，女36例，年齡60～82(73.51±5.17)歲;AD患者61例(AD組)，男29例，女32例，年齡60～86(78.57±4.58)歲。以同期在本院體檢健康的老年人63例為對照組，其符合2013年中國健康老年人標(biāo)準(zhǔn)，男30例，女33例，年齡62～88(69.02±5.40)歲。

簡易精神狀態(tài)量表(MMSE)評分依據(jù)：aMCI組文盲≤7分、小學(xué)≤20分、初中及以上文化≤24分;AD組臨床癡呆評定量表(CDR)≥1分;對照組MMSE評分正常。評分分值均由至少2名神經(jīng)內(nèi)科?？漆t(yī)師確認(rèn)。入選者必須排除嚴(yán)重心腦血管疾病、肝病、腎臟病、肺病、甲狀腺功能疾病、腫瘤性疾病、免疫系統(tǒng)異常疾病、神經(jīng)系統(tǒng)其他疾病引發(fā)的癡呆、精神疾病患者、維生素缺乏等。

1.2 血漿Hcy的測定

清晨采集空腹外周靜脈血4 mL，置于EDTA抗凝管中，離心分離血漿，-20 ℃ 冰箱保存。采用日立7600-020全自動(dòng)生化分析儀及Hcy測定試劑盒(深圳奧薩制藥有限公司)，應(yīng)用酶聯(lián)免疫法測定Hcy濃度，Hcy濃度≥15 μmol·L-1可診斷為HHcy。

1.3 基因組DNA的提取

用酚/氯仿常規(guī)抽提法提取基因組DNA，試劑盒由上海愛普拜斯應(yīng)用生物系統(tǒng)有限公司提供。

1.4 MTHFR C677T基因的多態(tài)性分析

采用MTHFR C677T檢測試劑盒，應(yīng)用ABI 7500型定量PCR及使用限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)(PCR-RFLP)技術(shù)檢測MTHFR C677T位單核苷酸多態(tài)性。試劑盒由深圳奧薩制藥有限公司提供。MTHFR基因包括CC純合子、TT純合子、CT雜合子三種類型。有C677T突變者，即基因型為CT或TT型者；無基因突變者為CC型。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS19.0軟件進(jìn)行處理。計(jì)量資料多組間比較采用單因素方差分析，計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組基線資料比較

aMCI組及AD組的年齡及Hcy濃度高于對照組。aMCI組、AD組和對照組中各有52例、51例和18例被診斷為HHcy。AD組的實(shí)際年齡及Hcy濃度高于aMCI組，但高血壓、糖尿病發(fā)生率與對照組比較未見明顯差異。見表1。

表1 3組基線資料比較

2.2 基因型及等位基因分布

aMCI組、AD組和對照組的MTHFR基因TT純合子分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.044<0.05)，進(jìn)一步比較得到，aMCI組和AD組的TT的分布頻率高于對照組，且AD組的TT的分布頻率高于aMCI組；aMCI組、AD組MTHFR基因C、T等位基因分布頻率與對照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 3組MTHFR基因型及等位基因分布

2.3 不同基因型血漿Hcy比較

采用單因素方差分析對MTHFR C677T不同基因型血漿Hcy水平進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較。如果組間有差異，進(jìn)一步采用Bonferroni進(jìn)行兩兩比較。3組三種基因型的Hcy水平均有差異(P<0.001)；AD組和aMCI組的TT基因型血漿Hcy水平明顯高于CC型(P<0.001)。見表3。

表3 3組MTHFR C677T不同基因型血漿Hcy的水平

3 討論

AD是一個(gè)多因素致病的復(fù)雜病理過程，包括基因突變、遞質(zhì)代謝異常、炎癥、氧化應(yīng)激、自由基損傷以及血管性病變等因素可導(dǎo)致β淀粉樣蛋白前體APP的異常裂解，使Aβ沉積[5]。HHcy是認(rèn)知功能減退，特別是晚發(fā)型AD的重要危險(xiǎn)因素。HHcy損害認(rèn)知功能的機(jī)制可能是Hcy導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化而損害認(rèn)知[6]，HHcy還可促進(jìn)氧自由基生成，對神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生毒性，特別是對海馬部神經(jīng)元毒性作用大，從而導(dǎo)致認(rèn)知損害[7]。Seshadri等[8]對1092名無癡呆健康受試者進(jìn)行一項(xiàng)橫斷面研究，分別檢測他們的血漿Hcy水平，在經(jīng)8年的隨訪后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)升高的血漿Hcy濃度是認(rèn)知功能損害發(fā)生發(fā)展的重要獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一。有學(xué)者[9]認(rèn)為AD及MCI患者腦萎縮面積越大，其血液中Hcy濃度越高。Kang等[4]對HHcy和MTHFR基因突變的相關(guān)性研究表明，MTHFR是Hcy代謝過程中的關(guān)鍵酶，編碼該酶的基因具有多態(tài)性，其中C677T

多態(tài)性最為常見，是指編碼該酶的基因的第4個(gè)外顯子在第677位的核苷酸堿基產(chǎn)生突變，由堿基T替換了堿基C，該突變導(dǎo)致了MTHFR的酶活性和熱穩(wěn)定性下降，繼而影響葉酸代謝，使Hcy甲基化過程受阻，從而導(dǎo)致Hcy在人體內(nèi)蓄積。MTHFR C677T基因突變后產(chǎn)生TT和CT兩種突變基因型。Ford等[10]研究表明，與野生CC基因型相比，TT基因型患者認(rèn)知功能障礙的發(fā)生率較高。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MTHFR基因TT純合子在aMCI及AD患者的分布頻率明顯高于正常認(rèn)知者，并且AD患者的分布頻率較aMCI患者更高。aMCI和AD患者的血漿Hcy水平明顯高于正常認(rèn)知者，且AD患者的Hcy水平高于aMCI患者。提示aMCI及AD患者的MTHFRC677T基因較易發(fā)生突變。本研究還發(fā)現(xiàn)aMCI和AD組MTHFR基因TT純合子型患者的Hcy水平明顯高于同組的CC純合子型患者。這些研究結(jié)果與以往相關(guān)研究結(jié)果一致[11]。由于本研究初期選取樣本時(shí)未考慮年齡及性別因素對Hcy濃度影響，因此統(tǒng)計(jì)結(jié)果可能存在相關(guān)偏倚。

本項(xiàng)研究表明，MTHFR C677T基因突變導(dǎo)致血漿Hcy升高，而HHcy與AD及aMCI的發(fā)生密切相關(guān)，且AD及aMCI組的MTHFR C677T基因的TT基因型及T等位基因分布和正常認(rèn)知組對比均有顯著差異。所以，筆者認(rèn)為MTHFR基因突變是導(dǎo)致認(rèn)知損害的危險(xiǎn)因素之一，并且MTHFR基因突變率影響著認(rèn)知功能障礙的程度。

MTHFR C677T基因突變及HHcy與aMCI、AD的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，HHcy亦是aMCI的一個(gè)重要危險(xiǎn)因素。汪琳等[12]發(fā)現(xiàn),及時(shí)補(bǔ)充葉酸和維生素B12可降低Hcy水平，所以在患者未出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙之前及時(shí)予以補(bǔ)充葉酸和維生素B12以降低Hcy水平，從而減少對神經(jīng)系統(tǒng)的毒性作用，以期減少aMCI及AD的發(fā)生。

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(責(zé)任編輯：羅芳)

Relationships of C677T Polymorphism of Methylenetetrahydrofolate Reductase and Plasma Homocysteine Levels to Amnestic Mild Cognitive Impairment

LI Yang-na,ZENG Hong-mei,ZHOU Lu,MA Li-na,WANG Si-xiang

(DepartmentofNeurology,theSecondAffiliatedHospitalofNanchangUniversity，Nangchang330006，China)

Objective To investigate the relationships of C677T polymorphism of methylenetetrahydrofolate reductase(MTHFR) and plasma homocysteine(Hcy) levels to amnestic mild cognitive impairment(aMCI).Methods Plasma Hcy levels were measured by ELISA and MTHFR C677T genotypes were detected by PCR in 65 patients with aMCI,61 patients with Alzheimer disease(AD) and 63 healthy elderly controls.Results Compared with control group,the levels of plasma Hcy and the distribution frequencies of TT genotype and T allele of MTHFR significantly increased in both aMCI and AD groups(P<0.05).Compared with patients with CC genotype,plasma Hcy levels markedly increased in patients with TT or CT genotype in groups aMCI and AD(P<0.001).Conclusion MTHFR gene C677T mutation and high Hcy levels are correlated with the occurrence and development of cognitive impairment.The hyperhomocysteinemia is an important risk factor for aMCI and AD.

amnestic mild cognitive impairment; Alzheimer disease; polymorphism; methylenetetrahydrofolate reductase; plasma homocystein; elderly

2017-03-12

李揚(yáng)娜(1990—)，女，研究生，主要從事神經(jīng)內(nèi)科學(xué)的研究。

曾紅梅，主任醫(yī)師，副教授，E-mail:zhm1209@sina.com。

R749.1

A

1009-8194(2017)03-0001-03

10.13764/j.cnki.lcsy.2017.03.001