布日額，陳香梅

（內(nèi)蒙古民族大學蒙醫(yī)藥學院，內(nèi)蒙古 通遼 028041）

·基礎(chǔ)研究·

哲里木科左中旗植被區(qū)甘草遺傳多樣性的ISSR分析

布日額，陳香梅

（內(nèi)蒙古民族大學蒙醫(yī)藥學院，內(nèi)蒙古 通遼 028041）

本文對哲里木植被區(qū)科左中旗具有代表性的6個區(qū)域的甘草遺傳多樣性進行研究，分析遺傳變異程度，得出結(jié)論哲里木植被區(qū)科左中旗甘草遺傳特征明顯，環(huán)境較為穩(wěn)定。

哲里木；甘草；遺傳多樣性；ISSR

甘草為我國所產(chǎn)的大宗藥材，是我國應用最為廣泛的一種藥用植物。在我國集中分布于三北地區(qū)，而內(nèi)蒙古是主要產(chǎn)區(qū)之一。近年來，已有運用RFLP，RAPD，ISSR等分子標記方法對不同產(chǎn)地甘草的遺傳多樣性研究的報道[1]。本試驗從哲里木植被區(qū)科爾沁左翼中旗具有代表性的6個區(qū)域采取野生甘草作為樣本，采用ISSR分子標記技術(shù)進行遺傳多樣性分析。采集的所有樣本均由內(nèi)蒙古民族大學布日額教授給予鑒定。

1 材料與儀器

1.1 材料

采自內(nèi)蒙古通遼市科爾沁左翼中旗6個區(qū)域，8份甘草單株樣本，選取新鮮無損害的葉片，分別對應編號，放入硅膠劑中干燥保存（表1）。

表1 采集甘草實驗材料

1.2 試劑和儀器

1.2.1 儀器

PCR擴增儀PCR-2720，JY-122型電泳儀，JY-SPC水平電泳槽，紫外凝膠成像系統(tǒng)（Tanon-4200），紫外分光光度計（200 C型），DK-SD型電熱恒溫水槽，內(nèi)吐C-16B離心機。

1.2.2 試劑

分子量Marker、TaqDNA聚合酶、溴化乙錠，購自北京賽百盛基因技術(shù)有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 DNA提取

采用多糖多酚植物DNA提取試劑盒（OMEGA生物技術(shù)有限責任公司）進行DNA提取。

2.2 ISSR-PCR反應條件建立及引物篩選

ISSR擴增反應條件：25 μL的反應體系12.5 μL PCR MasterMix（含3mmol·L-1MgCl2，100 mmol·L-1KCl，0.1U TaqDNA聚合酶，20 mmol·L-1Tris-HCl，500 mmol·L-1dNTP），2 μL引物，1 μL模板DNA，加雙蒸水至 25 μL。

根據(jù)相關(guān)文獻報道，由加拿大University of British Columbia，UBC Primer Set #9（Microsatellite），設(shè)計公布的引物No.801～900中選取38條引物，由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。對采集的8個甘草樣品進行預試驗，得到15條重復性好、擴增條帶清晰的引物，其序列和退火溫度見表2。

表2 15條引物名稱，序列及退火溫度

2.3 ISSR擴增及產(chǎn)物檢測

PCR擴增程序見表3。

表3 PCR反應條件

PCR產(chǎn)物在4℃保存。

取20 μLPCR產(chǎn)物，以Marker DNA Ladder為相對分子質(zhì)量標記，在1%瓊脂糖凝膠中電泳檢測，在凝膠成像儀上觀測結(jié)果，照相。引物ISSR 854和ISSR 895所擴增的PCR產(chǎn)物見圖1。

2.4 多態(tài)性譜帶分析

通過ISSR-PCR反應共得到15張圖譜，擴增條帶的相對分子質(zhì)量從1500～5000不等。15條引物共得到80條帶，其中21條表現(xiàn)出多態(tài)性，占總帶數(shù)的26.3%，平均每條引物擴增的DNA譜帶數(shù)為5條，多態(tài)位點百分率（PPB）在16.67%～40%。

圖1 ISSR 854引物擴增結(jié)果 ISSR 895引物擴增結(jié)果

3 討 論

甘草是豆科多年生藥用植物，是輕工業(yè)的重要原料。在中國主要集中于三北地區(qū)（東北、華北、西北），是中國傳統(tǒng)中藥。有研究結(jié)果表明[2]：甘草在不同地理群體中存在一定的遺傳多樣性；產(chǎn)地相距越遠，群體間相似性程度越低。

本試驗遺傳距離表明，哲理木植被區(qū)甘草的變異幅度較小，聚類分析結(jié)果表明各產(chǎn)地樣品間的遺傳差異較小，遺傳性狀穩(wěn)定。只有中哈干湖和德勝植被區(qū)域的甘草遺傳特征顯現(xiàn)較少，其他四個區(qū)域甘草的遺傳信息較為穩(wěn)定[3]。

[1] 風 艷,布日額.哲里木植被區(qū)草麻黃遺傳多樣性的ISSR分析研究[J].中國科技成果,2016,17(6):23-25.

[2] 布日額.哲里木草原植被區(qū)蒙古族民間利用植物藥資源及其藥學文化特點與蒙醫(yī)藥的比較研究[J].中國民族醫(yī)藥雜志,2015, 21(12):63-66.

[3] 布日額.哲里木蒙古族民間植物藥的初步研究[J].中國科技成果,2016,17(5):47-48.

本文編輯：王雨辰

S567.71

B

ISSN.2095-8242.2017.16.2974.02

內(nèi)蒙古自然科學基金重大項目資助（2013ZD11）