陶鵬輝

(信陽市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，河南信陽464000)

乙型肝炎病毒感染者血清HBV DNA與IL-21及IFN-γ水平的相關(guān)性

陶鵬輝

(信陽市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，河南信陽464000)

目的探討乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染者血清乙肝病毒脫氧核糖核酸(HBV-DNA)與白細(xì)胞介素21(IL-21)及γ-干擾素(IFN-γ)水平的相關(guān)性。方法選取我院收治的119例慢性乙肝患者，其中乙型肝炎(CHB)46例，乙肝后肝硬化(LC)41例，原發(fā)性肝癌(PHC)32例，同期選取35例肝功能檢查表面抗體為陽性的健康正常者作為對(duì)照，采用熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Fluorescence quantitative PCR，F(xiàn)Q-PCR)方法檢測HBV感染者血清HBV DNA，利用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(Enzymes linked immunosorbent assay，ELISA)檢測受試者血清IL-21及IFN-γ水平。結(jié)果CHB、LC、PHC三組患者之間血清IL-21、IFN-γ水平比較無顯著差異(P＞0.05)，與健康對(duì)照組比較差異顯著，且三組HBV感染者血清IL-21、IFN-γ水平明顯高于健康對(duì)照組(P＜0.05)；陰性組血清IL-21水平明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)，且隨著HBV DNA載量增加呈現(xiàn)明顯升高趨勢；陰性組血清IFN-γ水平明顯低于對(duì)照組(P＜0.05)，且隨著HBV DNA載量增加呈現(xiàn)明顯降低趨勢；相關(guān)性分析結(jié)果顯示，IL-21水平與HBV DNA載量呈較強(qiáng)正相關(guān)(rs=0.641，P＜0.05)，IFN-γ水平與HBV DNA載量呈現(xiàn)負(fù)性相關(guān)(rs=-0.372，P＜0.05)。結(jié)論IL-21、IFN-γ與HBV感染者血清HBV DNA持續(xù)感染密切相關(guān)，推測IL-21、IFN-γ有望成為HBV感染者免疫治療新靶點(diǎn)。

HBV；HBV DNA；IL-21；IFN-γ；相關(guān)性

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染是導(dǎo)致乙型肝炎(CHB)、肝硬化(LC)以及原發(fā)性肝癌(PHC)的主要原因[1]。目前，HBV感染已成為一個(gè)全球性公共衛(wèi)生問題，根據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道，全球范圍內(nèi)每年死于HBV感染者大約100萬人[2]。 HBV感染發(fā)病與機(jī)體免疫能力有關(guān)，并且依賴于HBV不斷的復(fù)制。研究表明[3]，血清HBV DNA是反映HBV在體內(nèi)復(fù)制及存在的重要指標(biāo)。研究HBV感染者血清HBV DNA與免疫相關(guān)因子之間相關(guān)性，有利于HBV感染發(fā)病機(jī)制的探究，因此，本研究旨在探討HBV感染者血清HBV DNA與免疫相關(guān)因子白細(xì)胞介素21(IL-21)及γ-干擾素(IFN-γ)的相關(guān)性，試圖為HBV感染發(fā)病機(jī)制提供一定的理論依據(jù)，以及為HBV感染治療提供免疫治療新靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料選取2015年2月至2016年2月信陽市中心醫(yī)院收治的119例慢性乙肝患者，其中男性72例，女性47例，年齡26～45歲，平均年齡37.43±3.17歲，CHB46例，LC41例，PHC32例，輕度肝臟損傷34例，中度肝臟損傷51例，重度肝臟損傷34例，所有患者診斷均符合2015年中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病分會(huì)聯(lián)合感染病學(xué)分會(huì)制定的慢性乙型肝炎防治指南(2015年版)。入選標(biāo)準(zhǔn)：⑴符合慢性乙型肝炎防治指南(2015年版)診斷標(biāo)準(zhǔn)者；⑵近期未使用任何免疫調(diào)節(jié)劑以及抗病毒藥物者；⑶排除其他病毒性肝炎及免疫缺陷病者；⑷排除伴有肝臟、心臟、腎臟等嚴(yán)重疾病者；⑸了解本研究，并同意簽署知情同意書者。

同期選取35例肝功能檢查表面抗體為陽性的健康正常者作為對(duì)照，其中男性19例，女性16例，年齡25～46歲，平均年齡36.53±4.16歲，入選標(biāo)準(zhǔn)：⑴肝功能檢查各指標(biāo)均正常者；⑵排除妊娠期或者哺乳期婦女；⑶排除伴有炎癥或者其他免疫性疾病者。

1.2 主要試劑熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Fluorescence quantitative PCR，F(xiàn)Q-PCR)試劑盒(購自于上?？迫A生物工程股份有限公司)，F(xiàn)Q-PCR擴(kuò)增儀(TL988-Ⅱ(48)孔，購自于西安天隆科技有限公司)，IL-21、IFN-γ酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(Enzymes linked immunosorbent assay，ELISA)檢測試劑盒(購自于上海森雄科技有限公司)，ELISA檢測儀(購自于美國BIO-RAD公司)。

1.3 方法采集HBV感染者清晨空腹?fàn)顟B(tài)下靜脈血5ml，離心分離血清，分裝于2支已滅菌試管中，-70℃保存待檢，利用FQ-PCR方法檢測HBV感染者血清HBV DNA，具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行；采集體檢肝功能正常者空腹?fàn)顟B(tài)下靜脈血3ml，利用ELISA檢測所有受試者血清IL-21及IFN-γ水平，具體操作嚴(yán)格按照ELISA試劑盒使用說明書進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析利用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Pearson法，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FQ-PCR檢測結(jié)果FQ-PCR檢測HBV感染者HBV DNA載量＜103copies·ml-1者36例，即DNA陰性組36例；103copies·ml-1≤HBV DNA載量≤104copies·ml-1者43例，即DNA低拷貝組43例，104copies·ml-1＜HBV DNA載量＜108copies·ml-1者40例，即DNA高拷貝組40例。

2.2 HBV感染者與健康對(duì)照組血清IL-21及IFN-γ水平比較CHB、LC、PHC三組患者血清IL-21水平均明顯高于健康對(duì)照組，差異均顯著，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，CHB、LC、PHC三組患者之間血清IL-21水平比較無顯著差異(P＞0.05)；CHB、LC、PHC三組患者血清IFN-γ水平均明顯高于健康對(duì)照組，差異均顯著，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，CHB、LC、PHC三組患者之間血清IFN-γ水平比較無顯著差異(P＞0.05)。具體結(jié)果見表1、圖1。

表1 HBV感染者與健康對(duì)照組血清IL-21及IFN-γ水平比較

圖1 HBV感染者與健康對(duì)照組血清IL-21及IFN-γ均數(shù)值

2.3 不同HBV DNA載量之間血清IL-21及IFN-γ水平比較DNA陰性組血清IL-21水平明顯高于健康對(duì)照組(P＜0.05)，DNA低拷貝組血清IL-21水平明顯高于DNA陰性組(P＜0.05)，DNA高拷貝組血清IL-21水平明顯高于DNA低拷貝組(P＜0.05)，即隨著HBV DNA載量增加，血清IL-21水平呈現(xiàn)明顯升高趨勢(P＜0.05)；DNA陰性組血清IFN-γ水平明顯高于健康對(duì)照組(P＜0.05)，DNA低拷貝組IFN-γ水平明顯低于DNA陰性組(P＜0.05)，DNA高拷貝組血清IFN-γ水平明顯低于DNA低拷貝組(P＜0.05)，即隨著HBV DNA載量增加，IFN-γ水平呈現(xiàn)明顯降低趨勢(P＜0.05)。具體結(jié)果見表2、圖2。

表2 不同HBV DNA載量之間血清IL-21及IFN-γ水平比較

圖2 不同HBV DNA載量血清IL-21及IFN-γ均數(shù)值

2.4 HBV DNA載量與血清IL-21及IFN-γ水平相關(guān)性分析相關(guān)性分析結(jié)果顯示，IL-21水平與HBV DNA載量呈較強(qiáng)正相關(guān)(rs=0.641，P＜0.05)，IFN-γ水平與HBV DNA載量呈現(xiàn)負(fù)性相關(guān)(rs=-0.372，P＜0.05)。

3 討論

HBV屬嗜肝病毒科，有包膜雙鏈DNA[4，5]，對(duì)于外界環(huán)境抵抗力極強(qiáng)，-20℃狀態(tài)下可存活15年之久。部分HBV感染者早期無任何明顯癥狀，是潛在的最為危險(xiǎn)的傳染源之一[6]。我國HBV感染流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示[7]，60%的人群被HBV感染過，10%的人群為HBsAg陽性攜帶者[8]。我國慢性HBV感染者已達(dá)1.1億人，每年死于CHB相關(guān)肝病者約30萬例，給我國社會(huì)及家庭造成了巨大的經(jīng)濟(jì)壓力。

HBV感染者發(fā)病與機(jī)體免疫功能有著極大的關(guān)系，免疫能力較強(qiáng)者感染HBV后，機(jī)體免疫系統(tǒng)通過免疫相關(guān)因子作用清除HBV，同時(shí)可獲得保護(hù)性抗體，若免疫能力差者感染HBV，由于機(jī)體無法及時(shí)清除HBV而發(fā)病，甚至進(jìn)一步發(fā)展為肝硬化、肝癌危及生命[9]。大量研究表明，HBV通常引起免疫系統(tǒng)損傷而導(dǎo)致肝臟發(fā)生病變。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為[10，11]，HBV發(fā)病機(jī)制與免疫系統(tǒng)介導(dǎo)以及HBV DNA復(fù)制密切相關(guān)。研究HBV感染者血清HBV DNA與免疫相關(guān)因子之間相關(guān)性具有十分重要的臨床價(jià)值。IL-21是一種具有多種功能的免疫相關(guān)細(xì)胞因子[12]，可促進(jìn)B細(xì)胞增殖分化，調(diào)節(jié)多種免疫蛋白產(chǎn)生，同時(shí)還可增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞活性，因此對(duì)于細(xì)胞免疫以及體液免疫均具有十分廣泛的調(diào)節(jié)作用。研究表明[13]，IL-21參與多種自身免疫性疾病的發(fā)生及發(fā)展，且在多種慢性病毒感染中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。因此，IL-21為HBV感染的免疫學(xué)治療提供了新方向。IFN-γ是Th1和NK細(xì)胞在免疫應(yīng)答過程中產(chǎn)生的一種具有高度生物活性的細(xì)胞因子。大量研究證實(shí)[14]，IFN-γ在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)以及抗病毒的作用。因此，本研究選取IL-21與IFN-γ兩個(gè)免疫相關(guān)細(xì)胞因子，研究其與HBV感染者血清HBV DNA載量的關(guān)系，試圖為HBV感染治療提供新的免疫治療靶點(diǎn)。

本研究結(jié)果表明，CHB、LC、PHC三組HBV感染者血清IL-21以及IFN-γ水平均明顯高于健康對(duì)照組，提示HBV感染機(jī)體引發(fā)免疫病理反應(yīng)，可刺激血清IL-21、IFN-γ產(chǎn)生，二者與CHB、LC、PHC發(fā)病均密切相關(guān)；DNA陰性組血清IL-21水平明顯高于健康對(duì)照組，DNA低拷貝組血清IL-21水平明顯高于DNA陰性組，DNA高拷貝組血清IL-21水平明顯高于DNA低拷貝組，可見隨著HBV DNA載量增加，血清IL-21水平呈現(xiàn)明顯升高趨勢，提示隨著HBV DNA含量的增加，機(jī)體免疫反應(yīng)發(fā)生越來越嚴(yán)重，血清IL-21水平可反應(yīng)不同HBV DNA含量所導(dǎo)致的免疫反應(yīng)程度，推測可作為HBV感染的免疫學(xué)生物指標(biāo)；DNA陰性組血清IFN-γ水平明顯高于健康對(duì)照組，DNA低拷貝組IFN-γ水平明顯低于DNA陰性組，DNA高拷貝組血清IFN-γ水平明顯低于DNA低拷貝組，由此可見，隨著HBV DNA載量增加，IFN-γ水平呈現(xiàn)明顯降低趨勢，與已知報(bào)道研究結(jié)果一致[15]，但與李彩東[16]等研究結(jié)果相反，提示IFN-γ與HBV感染患者血清HBV DNA載量密切相關(guān)，但其作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步深入研究；相關(guān)性分析結(jié)果顯示，IL-21水平與HBV DNA載量呈較強(qiáng)正相關(guān)，IFN-γ水平與HBV DNA載量呈現(xiàn)負(fù)性相關(guān)，提示二者與HBV感染者血清HBV DNA載量密切相關(guān)，有望成為HBV感染者免疫治療新靶點(diǎn)，值得更深入的進(jìn)一步探究。

綜上所述，IL-21、IFN-γ與HBV感染者血清HBV DNA載量密切相關(guān)，推測IL-21、IFN-γ有望成為HBV感染者免疫治療新靶點(diǎn)，但是本研究仍存在一些不足之處，如樣本量較少，研究機(jī)制不太完善，因此仍有待于進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量深入研究。

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Correlation of serum DNA HBV with IL-21 and IFN-in patients with HBV infection

TAO Penghui.
Department of Laboratory Medicine，Central Hospital of Xinyang City，Xinyang Henan，464000 China.

Objective To investigate the correlation of serum DNA HBV with IL-21 and IFN-in patients with HBV infection. Methods A total of 119 cases of chronic hepatitis B patients as the research object，which is CHB 46 cases，LC 41 cases，PHC 32 cases，selected 35 cases of liver function examination surface antibody positive healthy controls，F(xiàn)Q-PCR method for detection of HBV infection serum HBV DNA，detected by ELISA method and subjects of serum IL-21 and IFN-levels.Results CHB，LC，PHC three groups of patients with serum IL-21，IFN-levels were no significant difference(P＞0.05)，compared with the healthy control group had significant difference，and the three groups of HBV infected serum IL-21 and IFN-levels were significantly higher than those of the healthy control group(P＜0.05)；the level of IL-21 group were significantly higher than the negative the control group(P＜0.05)，and with the HBV DNA load increased significantly increased；Serum IFN-levels of the negative group were significantly lower than the control group(P＜0.05)，and with the HBV DNA load increased significantly decreased；Correlation analysis showed that the IL-21 level and HBV DNA load was strong positive correlation(rs=0.641，P＜0.05)，IFN-gamma level and HBV DNA load negatively related(rs=-0.372，P＜0.05).Conclusion IFN-and IL-21 are closely related to the persistent infection of DNA HBV in the serum of HBV infected persons，suggesting that IL-21 and IFN-are expected to be a new target for immunotherapy of HBV infection.

∶HBV；HBV DNA；IL-21；IFN-γ；Correlation

R512.6+2，R446.62

A

1674-1129(2017)03-0347-04

2016-12-16；

2017-05-05)

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.03.016

陶鵬輝，男，1972年生，本科學(xué)歷，學(xué)士學(xué)位，副主任檢驗(yàn)技師，研究方向是臨床免疫、生化、微生物學(xué)檢驗(yàn)。E-mail：taopenghui88@163.com。