郭全友 修艷輝,2 王魯民 姜朝軍 王 磊

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所， 上海 200090； 2.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院， 上海 201306)

魚源莓實(shí)假單胞菌生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)與碳源利用分析

郭全友1修艷輝1,2王魯民1姜朝軍1王 磊1

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所， 上海 200090； 2.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院， 上海 201306)

以魚源莓實(shí)假單胞菌為研究對(duì)象，利用BIOLOG獲得15、25、33℃下其GEN III板中碳源生長(zhǎng)數(shù)據(jù)，采用修正的Gompertz模型，結(jié)合孔平均顏色變化率及利用面積，分析其碳源利用效果，并對(duì)3個(gè)溫度下pH值、NaCl和乳酸鈉(NaL)的抑菌效應(yīng)和生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究。結(jié)果表明，25℃時(shí)莓實(shí)假單胞菌總體碳源利用能力和活性最強(qiáng)，15℃時(shí)次之，33℃時(shí)最弱。在15～33℃內(nèi)，碳源利用以糖類、羧酸類和氨基酸類為主。糖類中利用較好的有α-D-葡萄糖、L-巖藻糖等；氨基酸類中利用較好的有L-焦谷氨酸、L-丙氨酸、L-谷氨酸；羧酸類中利用較好的有奎寧酸、D-葡糖酸、糖質(zhì)酸等。15～25℃下4%～8% NaCl及33℃下1%～8% NaCl對(duì)莓實(shí)假單胞菌皆有抑制作用。33℃時(shí)pH值對(duì)莓實(shí)假單胞菌生長(zhǎng)起抑制作用，1%的NaL對(duì)其具有促進(jìn)作用。通過(guò)對(duì)莓實(shí)假單胞菌抑菌效應(yīng)和碳源利用分析，可為優(yōu)化產(chǎn)品配方和保障產(chǎn)品質(zhì)量提供理論依據(jù)。

莓實(shí)假單胞菌； 碳源利用能力； 環(huán)境因子； 生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)

引言

水產(chǎn)品腐敗變質(zhì)主要是由特定腐敗菌(Specific spoilage organism，SSO)增殖所造成，研究表明假單胞菌是水產(chǎn)品低溫貯藏時(shí)優(yōu)勢(shì)腐敗菌之一[1-3]，可在2～35℃范圍內(nèi)生長(zhǎng)[4-5]，能還原硝酸鹽為亞硝酸鹽[6]，也能引發(fā)某些水產(chǎn)品流行性疾病[7]。水產(chǎn)品原料、加工、流通和貯藏條件均會(huì)影響其保藏性，腐敗菌對(duì)脅迫環(huán)境(如溫度、pH值、NaCl含量等)的耐受性及營(yíng)養(yǎng)元素利用的差異[8]是影響貨架期的重要因素，若脅迫效應(yīng)超出細(xì)菌耐受的正常生理學(xué)范圍(Normal physiological range，NPR)，可能導(dǎo)致細(xì)菌生長(zhǎng)延緩、失活甚至死亡，同時(shí)，微生物進(jìn)行自我修復(fù)過(guò)程中，需要不斷消耗營(yíng)養(yǎng)來(lái)維持內(nèi)部平衡[9-10]。多孔平板技術(shù)是一種基于氧化還原反應(yīng)的高通量技術(shù)，它使得快速分析脅迫作用下細(xì)菌生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)及營(yíng)養(yǎng)利用情況成為可能。

微生物生長(zhǎng)和繁殖受物理、化學(xué)及生物因子的影響，假單胞菌生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)研究表明，在不同環(huán)境下其生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)(最大比生長(zhǎng)速率與遲滯期)差異較大，最大比生長(zhǎng)速率表示細(xì)菌對(duì)數(shù)期時(shí)的生長(zhǎng)速率，遲滯期表示細(xì)菌適應(yīng)環(huán)境的能力，是描述其生長(zhǎng)速率、抑菌效應(yīng)評(píng)價(jià)及貨架期預(yù)測(cè)模型的主要指標(biāo)[11]。郭全友等[12]研究表明：0～10℃假單胞菌遲滯期從59.63 h降至3.95 h，最大比生長(zhǎng)速率分別從0.02 h-1增至0.08 h-1，董慶利等[13]研究表明，pH值5.0時(shí)銅綠假單胞菌遲滯期約降低至pH值7.5時(shí)的1/2。此外，其營(yíng)養(yǎng)底物利用情況與菌種、初始菌量、底物種類及環(huán)境相關(guān)，如EBRAHIMI等[14]研究發(fā)現(xiàn)：在低pH值時(shí)植物乳桿菌能消耗更多谷氨酰胺，鼠李糖乳桿菌則相反；DENG等[15]研究表明：相比純底物，混合底物更能促進(jìn)木質(zhì)素降解菌的代謝活性。

微生物營(yíng)養(yǎng)利用情況可從能量代謝的角度進(jìn)行分析，包括微生物的代謝能力與方式。如研究多酚在腸道菌群的能量代謝方式，可為治療肥胖提供指導(dǎo)意義[16]，一些乳酸菌在進(jìn)行己糖發(fā)酵時(shí)，達(dá)到一定條件便可利用部分額外的NAD(P)H產(chǎn)生赤蘚糖醇和甘油，此外果糖、丙酮酸和檸檬酸鹽可作為細(xì)胞外部電子受體從而增大細(xì)菌的生長(zhǎng)速率[17]。目前，能量代謝分析方法主要從能量轉(zhuǎn)換和動(dòng)力學(xué)參數(shù)及代謝途徑進(jìn)行分析，吳雪楠等[18]采用微量量熱法研究了草甘膦對(duì)土壤微生物能量代謝的影響，在研究微生物群落分析時(shí)，可用動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行PCA分析，且每個(gè)參數(shù)包含著不同的生物信息[19]，門多薩假單胞菌利用葡萄糖產(chǎn)生中等鏈長(zhǎng)的聚羥基烷酸酯過(guò)程中，UDP-D-葡萄糖和DTDP-L-鼠李糖的生物合成途徑可能競(jìng)爭(zhēng)性抑制其合成，而通過(guò)阻斷支代謝途徑及過(guò)量表達(dá)phaG基因可增強(qiáng)其合成[20]。

本文以源自有氧冷藏大黃魚的重要腐敗菌(莓實(shí)假單胞菌)為研究對(duì)象，測(cè)定15、25、33℃條件下，以71種碳源為底物的莓實(shí)假單胞菌生長(zhǎng)數(shù)據(jù)，分析其碳源利用能力，以及不同pH值、NaCl和NaL溶液濃度對(duì)其生長(zhǎng)的影響，以期為優(yōu)化產(chǎn)品配方、有效抑菌及保障產(chǎn)品質(zhì)量提供一定依據(jù)，為深入探究在真實(shí)水產(chǎn)品中的營(yíng)養(yǎng)利用和抑菌效應(yīng)提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

從冷藏大黃魚貨架期終點(diǎn)，分離出腐敗菌并采用16S rRNA鑒定，菌株凍干保藏備用；HCl標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.01 mol/L)，深圳市博材達(dá)科技有限公司；營(yíng)養(yǎng)瓊脂(AR)、營(yíng)養(yǎng)肉湯(BR)，上海市國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；胰酪胨大豆肉湯(TSB)，上海中科昆蟲(chóng)生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 Biolog試驗(yàn)

取凍干莓實(shí)假單胞菌于BR中活化，經(jīng)兩代劃線復(fù)壯后，劃線得到單菌落，取適量接種到Biolog專業(yè)接種液中，混勻后靜置5 s后調(diào)節(jié)透光率至95%～98%之間，制備成吸光度約為0.01的菌懸液。然后使用Biolog專用移液器，分別吸取200 μL菌懸液到若干Gen III 96孔板中，分別置于15、25、33℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)97 h，間隔適當(dāng)時(shí)間經(jīng)Biolog儀(美國(guó)BIOLOG公司)中的Microstation讀數(shù)儀測(cè)定OD值。

1.2.2 總體碳源利用能力分析及模型評(píng)價(jià)

總體碳源利用能力用孔平均顏色變化率(Average well colour development，AWCD)表示，即用AWCD描述微生物代謝強(qiáng)度及平均活性，AWCD隨時(shí)間變化的曲線與微生物生長(zhǎng)曲線相似，包括變化前期、指數(shù)期和穩(wěn)定期，但觀察不到死亡階段[21]，公式為

AWCD=∑(C-R)/n

(1)

式中R——對(duì)照孔OD值C——含有碳源孔的OD值n——碳源孔數(shù)

此外，傳統(tǒng)微生物學(xué)預(yù)測(cè)模型常用Gompertz、Logistic和Baranyi方程對(duì)因變量(菌落數(shù)對(duì)數(shù)值)和自變量(時(shí)間t)關(guān)系進(jìn)行擬合[22]，用修正的Gompertz方程也可對(duì)培養(yǎng)時(shí)間與細(xì)菌OD值間關(guān)系進(jìn)行擬合[23]，其動(dòng)力學(xué)參數(shù)反映碳源利用速率及遲滯期，方程為

Vt=Aexp(-exp(2.718μmax(λ-t)/A+1))

(2)

式中t——時(shí)間，hλ——遲滯期，hVt——t時(shí)OD值，即C-R值μmax——顏色變化最大速率，h-1A——顏色變化最大吸光度

采用決定系數(shù)R2、準(zhǔn)確度Af、精確度Bf對(duì)模型進(jìn)行評(píng)價(jià)[24]，其中R2接近1表明擬合較好，Af接近1，準(zhǔn)確性較好，Bf接近1，精確性較好。

1.2.3 不同種類碳源利用能力及環(huán)境因子敏感性分析

Gen III板中有71種碳源，參照鄭華等[25]分類方法將其分為6類，分別為糖類(25種)、羧酸類(17種)、氨基酸類(10種)、胺/酰胺類(6種)、脂肪酸/脂類(6種)和其他類(7種)。當(dāng)莓實(shí)假單胞菌OD值穩(wěn)定時(shí)，即V0>0.25時(shí)[26]，判為可利用。

溫度對(duì)莓實(shí)假單胞菌碳源利用模式的影響用碳源利用率表示(Sm/Sz，Sm表示每類碳源的利用面積，Sz表示全部碳源的利用面積)。不同種類碳源及單個(gè)碳源利用能力，采用利用面積S及動(dòng)力學(xué)參數(shù)(μmax和λ)分析，碳源利用面積公式為

(3)

式中Vti——ti時(shí)OD值

環(huán)境因子(如化學(xué)物質(zhì))對(duì)莓實(shí)假單胞菌敏感性的影響以陽(yáng)性對(duì)照孔(A10)作參考，當(dāng)試劑孔(OD值)與A10孔接近，顯紫色或接近紫色時(shí)，判為陽(yáng)性(+)，反之，判為陰性(-)，即試劑孔易被該化學(xué)物質(zhì)抑制。當(dāng)呈現(xiàn)陽(yáng)性時(shí)，生長(zhǎng)曲線常呈現(xiàn)“S”型，顯示為生長(zhǎng)(如μmax>0)，即起促進(jìn)作用。如果不能準(zhǔn)確判斷，將其判定為“邊界值”()。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用軟件SPSS 19.0(美國(guó)IBM公司)利用最小二乘算法進(jìn)行非線性回歸求出參數(shù)，采用軟件Origin 8.0(美國(guó)OriginLab公司)制圖，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析。菌株序列采用NCBI 中 BLAST 與 GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中已知16S rRNA序列進(jìn)行對(duì)比，并用 Mega 5.0 軟件通過(guò)最大似然值法構(gòu)建發(fā)育樹(shù)[27]。

2 結(jié)果與討論

2.1 莓實(shí)假單胞菌來(lái)源與總體碳源利用

在有氧冷藏(0～10℃)大黃魚貨架期終點(diǎn)時(shí)，分離出腐敗希瓦氏菌(Shewanellaputrefaciens)、假單胞菌(Pseudomonasspp.)、缺陷短波單胞菌(Brevundimonasdiminuta)、不動(dòng)桿菌(Acinetobacterspp.)等腐敗菌群[1]，經(jīng)16S rRNA測(cè)序確定希瓦氏菌(樣品1)和莓實(shí)假單胞菌(樣品2)為優(yōu)勢(shì)菌群，同源性最高分別為98%和100%，如圖1所示。同時(shí)，假單胞菌也是冷藏淡水魚(如羅非魚等)的特定腐敗菌，受食品營(yíng)養(yǎng)組成、質(zhì)地結(jié)構(gòu)和脅迫條件的影響，其營(yíng)養(yǎng)代謝和生長(zhǎng)速率存在較大差異。本文以源自冷藏大黃魚的莓實(shí)假單胞菌為模式菌株，對(duì)不同溫度下其碳源利用情況進(jìn)行探究(圖2)。

圖1 樣品1和樣品2菌株16S rRNA的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.1 Phylogenetic tree of sample 1 and sample 2 strains’ 16S rRNA

圖2為不同溫度下莓實(shí)假單胞菌總體碳源利用狀況。賈夏等[28]對(duì)微生物群落特征分析得出，240 h培養(yǎng)周期內(nèi)AWCD曲線“拐點(diǎn)”前后差異顯著(p<0.05)，而CLASSEN等[29]認(rèn)為培養(yǎng)時(shí)間超過(guò)72 h時(shí)，細(xì)菌板逐漸表現(xiàn)出真菌性增長(zhǎng)。本研究得到100 h培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)總體碳源利用如圖2所示，總體碳源利用曲線呈S型，25℃時(shí)μmax最大，AWCD最大值為0.614，表明總體碳源利用能力和活性最強(qiáng)，15℃時(shí)次之，AWCD最大值為0.402，33℃時(shí)最弱，AWCD最大值為0.198；圖2中15℃和25℃時(shí)的λ相差不大，33℃時(shí)較大，而λ越小意味著適應(yīng)環(huán)境能力越強(qiáng)，進(jìn)入對(duì)數(shù)期時(shí)間越短，觀察到其與活性之間并無(wú)直接關(guān)系。如銅綠假單胞菌在35℃時(shí)活性最大，但其λ在21～42℃范圍內(nèi)隨著溫度升高而降低[13]。

2.2 不同類型碳源利用能力分析

表1為6類碳源及不同溫度下可利用的碳源種類，可看出15℃和25℃可利用碳源總數(shù)均為39種，33℃時(shí)迅速降至20種。圖3a為莓實(shí)假單胞菌每類碳源利用面積占總利用面積的百分比，可知：在15～33℃范圍內(nèi)，莓實(shí)假單胞菌利用碳源以糖類、羧酸類和氨基酸類為主，利用率均值分別為(29±0.010)%、(29±0.014)%和(20±0.032)%；溫度對(duì)莓實(shí)假單胞菌各類碳源利用率變化不明顯。圖3b為莓實(shí)假單胞菌每類碳源利用面積，可知：25℃時(shí)6類碳源利用能力均最高，15℃次之，33℃最低，三者之間差異顯著(p<0.05)，與總體碳源利用曲線規(guī)律類似；溫度對(duì)莓實(shí)假單胞菌各類碳源的利用面積變化明顯，這是由于微生物群落中不同微生物種類的環(huán)境耐受性差異所致。

圖4為不同溫度條件下6類可利用碳源的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。由圖4a可看出，每類碳源(除其他類外)25℃時(shí)μmax大于或接近于15℃時(shí)，33℃時(shí)μmax最小，如羧酸類在15、25、33℃時(shí)μmax分別為0.015、0.022、0.010 h-1，氨基酸類在15、25℃時(shí)μmax為0.021 h-1和0.022 h-1，33℃時(shí)降為0.007 h-1；由圖4b看出，每類碳源的遲滯期隨著溫度升高而降低，如糖類λ在15～33℃時(shí)由21.7 h降至8.7 h，羧酸類由21.3 h降至10.5 h。Baranyi模型、Logistic模型和Gompertz模型是常見(jiàn)的食品微生物生長(zhǎng)模型，修正Logistic方程和修正Gompertz方程可克服傳統(tǒng)模型函數(shù)漸進(jìn)值相同進(jìn)而導(dǎo)致拐點(diǎn)處函數(shù)值相同的缺陷，更適用于研究“S”形微生物的生長(zhǎng)曲線[22]，雖然相同模型針對(duì)不同研究對(duì)象會(huì)出現(xiàn)不同預(yù)測(cè)結(jié)果，但修正的Gompertz方程的預(yù)測(cè)效果仍被證明較好，并得以廣泛應(yīng)用[30]，本文中擬合的模型R2為0.986±0.032，Af為0.946±0.055，Bf為1.047±0.014，表明模型能較好擬合15～33℃范圍內(nèi)莓實(shí)假單胞菌碳源利用情況。

表1 碳源分類以及利用情況

注：“+++”等符號(hào)代表15、25、33℃下該碳源被利用情況，“+”代表可被利用，“-”代表不可被利用。

圖3 不同溫度下莓實(shí)假單胞菌對(duì)6類碳源的相對(duì)利用率及利用面積的影響Fig.3 Carbon sources’ utilization proportion and area of Pseudomonas fragi at different temperature

圖4 不同溫度對(duì)莓實(shí)假單胞菌各類碳源利用的影響Fig.4 Effect of different temperatures on carbon sources utilization of Pseudomonas fragi

2.2.1 不同溫度下糖類利用差異性

圖5 莓實(shí)假單胞菌利用糖類碳源的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Fig.5 Kinetic parameters of carbohydrates utilization of Pseudomonas fragi

圖5為莓實(shí)假單胞菌每種可利用糖類碳源的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，莓實(shí)假單胞菌的碳源利用情況可綜合最大比生長(zhǎng)速率、遲滯期和利用面積進(jìn)行評(píng)價(jià)，如15℃時(shí)蜜三糖μmax雖然較大(0.014 h-1)，但由于λ長(zhǎng)(45.6 h)，利用面積最小(11)，利用較差；15℃水蘇糖μmax最大(0.021 h-1)，而λ較長(zhǎng)(53.3 h)，但由于最大AWCD大，所以利用面積較大(24)，利用較好。因此得出結(jié)論：15℃時(shí)α-D-葡萄糖、L-巖藻糖利用最好；其次為D-半乳糖、D-甘露醇、蔗糖、水蘇糖；阿拉伯醇、果糖和蜜三糖利用較差。25℃時(shí)利用較好的有蔗糖、L-巖藻糖、D-甘露醇，其次為D-半乳糖、D-甘露糖和α-D-葡萄糖；阿拉伯糖和果糖利用較慢。33℃時(shí)L-巖藻糖和蔗糖利用較好，D-阿拉伯醇和D-半乳糖利用較差。此外，D-巖藻糖隨溫度升高利用面積增大，而水蘇糖、蜜三糖隨溫度升高利用面積變小。在實(shí)際應(yīng)用中，孫俊良等[31]發(fā)現(xiàn)幾種糖類碳源對(duì)黑曲霉產(chǎn)糖化酶活力從大到小依次為：可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖和麥芽糖、乳糖、β-環(huán)糊精，基本只能利用前4種。功能菌1-24和B-31分別在葡萄糖和淀粉條件下生長(zhǎng)情況最佳，麥芽糖對(duì)功能菌ETSA的促進(jìn)效果最強(qiáng)[32]。

2.2.2 對(duì)氨基酸類的利用

莓實(shí)假單胞菌對(duì)氨基酸類利用能力動(dòng)力學(xué)參數(shù)如圖6所示。由圖6可知，15℃時(shí)L-焦谷氨酸利用最好，為0.029 h-1，其次為γ-氨基-丁酸、L-谷氨酸和D-絲氨酸、L-丙氨酸，μmax均值為0.024 h-1，L-絲氨酸利用較差。25℃時(shí)利用較好的有D-絲氨酸(0.048 h-1)、L-丙氨酸(0.035 h-1)，其次為L(zhǎng)-焦谷氨酸、γ-氨基-丁酸、L-天冬氨酸和L-谷氨酸；氨基乙酰脯氨酸利用最慢；33℃時(shí)利用較好的有L-谷氨酸，其次為天冬氨酸和焦谷氨酸，D-絲氨酸利用最差。此外，15℃時(shí)L-絲氨酸λ長(zhǎng)達(dá)33.4 h，可看出其適應(yīng)能力較弱。

圖6 莓實(shí)假單胞菌利用氨基酸類碳源的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Fig.6 Kinetic parameters of amino acids utilization of Pseudomonas fragi

生物體內(nèi)存在以及可利用的絕大多數(shù)為L(zhǎng)-氨基酸，D-氨基酸利用少或被分解氧化，D-氨基酸是肽聚糖的重要組成部分，其合成被破壞將導(dǎo)致細(xì)胞的死亡[33]，也有人發(fā)現(xiàn)在細(xì)菌生長(zhǎng)速率很高時(shí)可以釋放和消耗D-氨基酸[34]。D-氨基酸對(duì)海洋中碳源和能源的循環(huán)很重要[35]。

2.2.3 對(duì)羧酸類的利用

莓實(shí)假單胞菌對(duì)羧酸類利用能力動(dòng)力學(xué)參數(shù)如圖7所示，15℃時(shí)奎寧酸、D-葡萄糖酸、D-葡萄糖醛酸、糖質(zhì)酸、L-蘋果酸利用較好。25℃時(shí)D-葡萄糖酸、D-葡萄糖醛酸、糖質(zhì)酸、奎寧酸、L-蘋果酸利用較好。33℃時(shí)為奎寧酸、糖質(zhì)酸利用較好。粘酸的利用速率普遍較高，但λ長(zhǎng)達(dá)55 h以上，且最大AWCD較小，利用較差。羧酸常被作為食品、材料表面等的防腐劑，VZQUEZ等[36]通過(guò)二級(jí)方程發(fā)現(xiàn)羧酸對(duì)幾株菌的毒性作用隨著分子量的增大而降低。本文中看出莓實(shí)假單胞菌可利用甲酸、乙酸和丙酸，其利用速率與分子量成正比。

圖7 莓實(shí)假單胞菌利用羧酸類碳源的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Fig.7 Kinetic parameters of carboxylic acids utilization of Pseudomonas fragi

2.2.4 對(duì)脂肪酸/脂類、胺/酰胺類和其他類的利用

莓實(shí)假單胞菌對(duì)脂肪酸/脂類、胺/酰胺類和其他類利用能力動(dòng)力學(xué)參數(shù)如圖8所示，脂肪酸和脂類在15℃和25℃時(shí)對(duì)丙酮酸甲酯(0.009 h-1)、β-羥基-D,L-丁酸(0.008 h-1)的利用較好，不同的是最大AWCD不同；33℃利用均較差。吐溫40μmax雖然與其他差距不大，但其λ長(zhǎng)而導(dǎo)致利用能力差。15℃和25℃時(shí)對(duì)L-組胺利用較好(S為0.037和0.027)，33℃時(shí)，葡糖醛酰胺利用較好(S為0.011)，15～25℃時(shí)對(duì)肌苷利用最好(S為0.017和0.029)，其次是肌醇(S為0.011和0.017)，33℃時(shí)反之。葡糖醛酰胺只在33℃時(shí)被利用，溫度越高利用面積越大。本文中莓實(shí)假單胞菌并不利用明膠，同屬菌株a390T可水解明膠[37]。

圖8 莓實(shí)假單胞菌利用脂肪酸/脂類、胺/酰胺類和其他類碳源的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Fig.8 Kinetic parameters of fatty acids/lipids, amines/amides and others utilization of Pseudomonas fragi

2.3 環(huán)境因子下莓實(shí)假單胞菌敏感性分析

圖9為不同溫度下pH值、NaCl和NaL對(duì)莓實(shí)假單胞菌生長(zhǎng)的影響。由圖9可看出，15℃下pH值6.0和pH值5.0時(shí)的最大比生長(zhǎng)速率比較接近，均值為(0.088±0.023) h-1，25℃ pH值6.0時(shí)最大

比生長(zhǎng)速率(0.129 h-1)遠(yuǎn)大于pH值5.0(0.093 h-1)時(shí)，而在33℃時(shí)pH值對(duì)其起抑制作用。15℃和25℃下1%的NaCl以及1%的NaL能促進(jìn)生長(zhǎng)，4%～8%的NaCl對(duì)莓實(shí)假單胞菌生長(zhǎng)均有抑制作用，33℃只有1%的NaL具有促進(jìn)作用。

圖9 不同溫度下pH值以及NaCl和NaL對(duì)莓實(shí)假單胞菌生長(zhǎng)的影響Fig.9 Effect of pH value, NaCl and NaL on growth of Pseudomonas fragi at different temperatures

莓實(shí)假單胞菌生長(zhǎng)過(guò)程中可改變環(huán)境的pH值，有研究表明1℃下貯藏20 d的牛肉中莓實(shí)假單胞菌菌數(shù)由2.2 lg CFU/cm2增加到7.2 lg CFU/cm2時(shí)，pH值由5.5增至6.6[38]。而有些物質(zhì)的產(chǎn)生對(duì)pH值的變化比較敏感，如木糖酸的產(chǎn)生對(duì)pH值的降低十分敏感[39]。相同溫度下，NaCl濃度越高，利用速率越小，這是由于NaCl改變了莓實(shí)假單胞菌生長(zhǎng)環(huán)境的滲透壓，高滲條件會(huì)引起細(xì)胞質(zhì)質(zhì)壁分離，細(xì)胞生長(zhǎng)變慢而停止。NaL促進(jìn)莓實(shí)假單胞菌生長(zhǎng)，15℃時(shí)尤為明顯。NaL在水產(chǎn)品中常作為保鮮劑，常和其他抗菌劑、包裝方式[40]、殺菌處理[41]共同抑菌，如SCHELEGUEDA等[42]通過(guò)研究無(wú)害李斯特氏菌(Listeriainnocua)、腐敗希瓦氏菌和嗜冷菌等混合菌株的抗微生物劑釋放、細(xì)胞表面疏水性和損傷部位的確定，確定最小抑菌劑量以及發(fā)現(xiàn)NaL和其他抗菌物質(zhì)組合的抑菌效果更佳。文獻(xiàn)[43]認(rèn)為1%～2%的NaL在肉制品中也有抑菌效果，在本文中1%NaL對(duì)其影響不顯著，這可能是抑菌對(duì)象不同所造成，如ILHAK等[44]研究發(fā)現(xiàn)與單獨(dú)2% NaL處理的樣品相比，0.1%的百里酚與2%NaL的組合沒(méi)有顯示出對(duì)李斯特氏菌顯著抑制作用，而對(duì)Salmonellatyphimurium卻表現(xiàn)出協(xié)同效應(yīng)。

3 結(jié)論

(1)25℃時(shí)莓實(shí)假單胞菌總體碳源利用能力和活性最強(qiáng)，15℃時(shí)次之，33℃時(shí)最弱。在15～33℃范圍內(nèi)，莓實(shí)假單胞菌利用碳源以糖類、羧酸類和氨基酸類為主，碳源利用率均值分別為29%、29%和20%。莓實(shí)假單胞菌對(duì)各類碳源的利用率變化不明顯；溫度對(duì)莓實(shí)假單胞菌每類碳源利用率變化明顯。

(2)糖類中利用較好的有α-D-葡萄糖、L-巖藻糖、蔗糖和D-甘露醇。氨基酸類中利用較好的有L-焦谷氨酸、D-絲氨酸、L-丙氨酸、L-谷氨酸。羧酸類中利用較好的有奎寧酸、D-葡萄糖酸、D-葡萄糖醛酸、糖質(zhì)酸、L-蘋果酸。脂肪酸/脂類、胺/酰胺類和其他類中利用較好的有丙酮酸甲酯(0.009)、β-羥基-D,L-丁酸、L-組胺、葡萄糖醛酰胺、肌苷、肌醇。

(3)15℃下，pH值6.0和pH值5.0時(shí)的最大比生長(zhǎng)速率比較接近，25℃ pH值6.0時(shí)最大比生長(zhǎng)速率遠(yuǎn)大于pH值5.0時(shí)，而在33℃時(shí)2個(gè)pH值對(duì)其起抑制作用。15℃和25℃下1%的NaCl以及1%NaL能促進(jìn)生長(zhǎng)，4%～8%的NaCl對(duì)莓實(shí)假單胞菌生長(zhǎng)均有抑制作用，33℃只有1%NaL具有促進(jìn)作用。

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Growth Kinetics and Carbon Utilization Analysis ofPseudomonasfragifrom Fish

GUO Quanyou1XIU Yanhui1,2WANG Lumin1JIANG Chaojun1WANG Lei1

(1.EastChinaSeaFisheriesResearchInstitute,ChineseAcademyofFisherySciences,Shanghai200090,China2.CollegeofFoodScienceandTechnology,ShanghaiOceanUniversity,Shanghai201306,China)

Pseudomonasfragiis one of the specific spoilage organisms (SSOs) in aquatic food, especially in refrigeration stage. Aiming to investigate carbon utilization ofP.fragiat different temperatures and study the effect of pH value, NaCl and sodium lactate on growth ofP.fragibased on the kinetics of colour formation. Firstly, bacterial suspension was inoculated in Biolog GEN III plates, respectively incubating at different temperatures (15℃, 25℃ and 33℃). Then the data were fitted by the modified Gompertz equation and kinetic parameters were estimated. Through kinetic parameters (maximum specific growth rate and lag phase), and combining utilization area (S) and average well colour development (AWCD) value, the effect of carbon source utilization at different temperatures and environment factors onP.fragiwas analyzed. Results showed that at 25℃P.fragihad the highest carbon utilization and activity ability, which was followed by 15℃, and the lowest value was got at 33℃. At 15～33℃,P.fragimainly used carbohydrates, amino acids and carboxylic acids. Moreover, the effect of changes of different temperatures on various kinds of carbon sources utilization was obvious, while the effect of changes of different temperatures on utilization rates was not obvious. In carbohydrates α-D-glucose, L-fucose, sucrose and D-mannitol could be better utilizated. In amino acids L-pyroglutamic acid, D-serine, L-alanine, L-glutamic acid could be better utilized. And in carboxylic acids quinic acid, D-gluconic acid, D-glucuronic acid, D-saccharic acid, L-malic acid were better utilized. At 15℃ the pH value was kept at 6.0 or 5.0, which the color maximum rates of color development were close, while at 25℃, pH value of 6.0 was far greater than at pH value of 5.0, and at 33℃ at any pH value, the growth ofP.fragiwas inhibited. At 15～25℃, 4%～8% NaCl and at 33℃, 1%～8% NaCl or pH value of 6.0 or pH value of 5.0, the growth ofP.fragiwas inhibited, and at 15～25℃, 1% NaCl or pH value of 6.0, pH value of 5.0 and at 33℃, 1% NaL the growth ofP.fragiwas promoted. The antibacterial effect onP.fragiand carbon utilization was analyzed which can provide a theoretical basis for optimizing product formulation and guaranteeing product quality.

Pseudomonasfragi; carbon utilization ability; environmental factors; growth kinetics

10.6041/j.issn.1000-1298.2017.06.042

2016-10-25

2016-11-21

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31371867)、上海市自然科學(xué)基金項(xiàng)目(16ZR1444900)和中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目(2011M04、2014G02)

郭全友(1974—)，男，副研究員，主要從事水產(chǎn)品加工與安全保障研究,E-mail： dhsguoqy@163.com

王魯民(1963—)，男，研究員，主要從事漁業(yè)工程材料與設(shè)施研究,E-mail： lmwang@ecsf.ac.cn

TS254.4

A

1000-1298(2017)06-0319-09