余潔麗 邱宇安 劉利艷 陳文學(xué) 靳文劍 陳火國(guó) 鐘 寧

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RNA干擾Nodal基因?qū)ξ赴┘?xì)胞凋亡及血管生成的影響

余潔麗 邱宇安 劉利艷 陳文學(xué) 靳文劍 陳火國(guó) 鐘 寧

目的 構(gòu)建并鑒定Nodal基因的RNA慢病毒表達(dá)載體，探討Nodal基因?qū)ξ赴┘把苌傻淖饔?。方?針對(duì)Nodal mRNA設(shè)計(jì)siRNA，構(gòu)建慢病毒質(zhì)粒，測(cè)序鑒定質(zhì)粒構(gòu)建成功。將構(gòu)建的慢病毒質(zhì)粒及包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，鑒定慢病毒包裝成功，并測(cè)定其滴度。將慢病毒轉(zhuǎn)染人胃腺癌細(xì)胞株MKN-45，通過(guò)qPCR檢測(cè)Nodal基因表達(dá)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。Cellomics儀觀察人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)血管生成。結(jié)果 通過(guò)測(cè)序顯示，插入Nodal基因RNAi序列正確。包裝后測(cè)定病毒滴度達(dá)(5.0×108)TU/ml，qPCR檢測(cè)提示RNA干擾病毒轉(zhuǎn)染MKN-45細(xì)胞株后，Nodal基因表達(dá)水平顯著下降。干擾后胃癌細(xì)胞凋亡率明顯上升(P<0.05)，干擾Nodal基因?qū)ρ苌蔁o(wú)顯著影響(P>0.05)。結(jié)論 成功構(gòu)建了人Nodal基因的RNAi慢病毒表達(dá)系統(tǒng)。干擾Nodal基因顯著增加胃癌細(xì)胞凋亡。

Nodal；RNA干擾；慢病毒載體；胃腫瘤；血管生成

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:401～404)

胃癌是僅次于肺癌的第二大致死性腫瘤。本課題組前期研究提示在人胃低分化腺癌組織中，Nodal蛋白呈高表達(dá)。體外培養(yǎng)的胃癌細(xì)胞株Nodal基因亦明顯表達(dá)。我們進(jìn)一步構(gòu)建了Nodal基因RNA干擾重組慢病毒載體，并進(jìn)行了相關(guān)功能學(xué)研究。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

限制性內(nèi)切酶(NEB公司)，Taq Plus DNA polymerase(Vazyme公司)，T4 DNA ligase(Thermo Scientific 公司)，EndoFree midi Plasmid Kit(TIANGEN 公司)，NormalRunTM 250 bp-II DNA Ladder(GeneRay 公司)，Puromycin(clontech公司)，dNTPs(promega 公司)，oligo dT(上海生工公司)，Bulge-LoopTM miRNA qPCR Primer Set(廣州銳博公司 )，Primer(上海吉?jiǎng)P公司)，凋亡試劑盒(eBioscience公司)，Matrigel(Corning公司)，Calcein AM(上海翊圣生物科技有限公司)。

1.2 主要儀器

Cellomics儀(Thermo公司)，流式細(xì)胞儀(Millipore公司)，生物安全柜(上海振樣創(chuàng)空氣凈化設(shè)備公司)，CO2培養(yǎng)箱(日本三洋公司)，穩(wěn)壓電泳儀(上海天能公司)，超細(xì)勻漿機(jī)(FLUKO公司公司)，Real time PCR 儀器(Roche公司)，分光光度計(jì)(Thermo公司)，熒光顯微鏡(奧林巴斯)。

1.3 質(zhì)粒及細(xì)胞株

人胃腺癌細(xì)胞株MKN-45；慢病毒系統(tǒng)包括骨架質(zhì)粒GV248(元件順序hU6-MCS-Ubiquitin-EGFP-IRES-puromycin AgeI / EcoRI 酶切)、包裝質(zhì)粒pHelper 1.0、pHelper 2.0；包裝細(xì)胞293T(均購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司)。

1.4 Nodal基因的RNAi慢病毒載體構(gòu)建及鑒定

設(shè)計(jì)合成針對(duì)Nodal的3條siRNA：①NODAL-RNAi(44787-1)：5’-AGACCAAGCCGCTGAGCAT-3’②NODAL-RNAi(44788-1)：5’-CGACATCACTTGCCAGACA-3’③NODAL-RNAi(44789-1)：5’-CAACAAGAGGATCTGGCAT-3’。陰性對(duì)照5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’。將引物退火形成雙鏈DNA，通過(guò)T4 DNA ligase將雙酶切線性化的載體(GV248)和退火雙鏈DNA連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，感受態(tài)細(xì)胞中培養(yǎng)擴(kuò)增。對(duì)陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)化子進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證其正確性。對(duì)測(cè)序正確的菌液進(jìn)行質(zhì)粒抽提。將3種質(zhì)粒載體(重組質(zhì)粒及pHelper 1.0、pHelper 2.0)共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，進(jìn)行慢病毒濃縮純化及病毒滴度測(cè)定。

1.5 篩靶實(shí)驗(yàn)

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MKN-45細(xì)胞，胰酶進(jìn)行消化成細(xì)胞懸液，接種于12孔板。感染條件Eni.S(enhance infection solution)+polybrene，待細(xì)胞融合度達(dá)到30%，在感染復(fù)數(shù)(MOI)為20的情況下進(jìn)行慢病毒感染。感染72h后，進(jìn)行熒光拍照。Real-time qPCR檢測(cè)Nodal RNAi慢病毒感染后，MKN-45細(xì)胞Nodal基因的表達(dá)。

1.6 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞感染后，培養(yǎng)至貼壁生長(zhǎng)。胰酶消化，重懸成細(xì)胞懸液，收集于5 mL離心管中，每組設(shè)三個(gè)復(fù)孔。1 300 rmp 離心5 min，棄上清，4 ℃預(yù)冷的D-Hanks(pH=7.2～7.4)洗滌細(xì)胞沉淀。1×binding buffer 洗滌細(xì)胞沉淀一次，1300 rmp、3 min離心，收集細(xì)胞。200 μL 1×binding buffer 重懸細(xì)胞沉淀。加入10 μL Annexin V-APC 染色，室溫避光10～15 min。上機(jī)檢測(cè)。

1.7 血管生成實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞感染后，鋪2×105個(gè)細(xì)胞于6孔板中，待貼壁后，D-Hanks洗滌2遍，換無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，收集上清。提前1天將Matrigel從-20 ℃中取出，4 ℃放置過(guò)夜融化，并將實(shí)驗(yàn)用孔板及槍頭-20 ℃預(yù)冷。待Matrigel融化充分后，于預(yù)冷的96孔板中鋪Matrigel，每孔70 μL，37 ℃凝固30 min，備用。消化HUVEC細(xì)胞，用無(wú)血清培養(yǎng)基洗細(xì)胞2～3次，盡量將血清去除干凈，用預(yù)先收集的目的細(xì)胞培養(yǎng)上清重懸為2×104細(xì)胞/100 μL，鋪96孔板。37 ℃培養(yǎng)預(yù)設(shè)時(shí)間(4～6 h)后，每孔加入2 μM Calcein AM，室溫孵育10～20 min。置于Cellomics儀中掃板，獲得圖片及數(shù)據(jù)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 重組慢病毒載體的測(cè)序

對(duì)構(gòu)建的3個(gè)重組質(zhì)粒進(jìn)行DNA測(cè)序，結(jié)果見(jiàn)圖1。測(cè)序結(jié)果顯示，測(cè)定序列與目的序列一致。提示插入Nodal基因RNAi序列正確。

圖1 慢病毒重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果

2.2 重組慢病毒載體的包裝及鑒定

將3種質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后96 h，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞，見(jiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)良好，熒光強(qiáng)烈。測(cè)定病毒滴度為5×108TU/ml。

2.3 qPCR檢測(cè)RNA干擾后Nodal基因的表達(dá)

RNAi慢病毒感染后，MKN-45細(xì)胞Nodal基因的表達(dá)水平顯著下調(diào)。LV-NODAL-RNAi(44787-1)感染、LV-NODAL-RNAi(44789-1)感染分別下調(diào)了80.3%和84.9%。

2.4 RNA干擾Nodal基因?qū)KN-45細(xì)胞凋亡的影響

shRNA慢病毒感染MKN-45細(xì)胞，培養(yǎng)5天后，干擾組凋亡率與對(duì)照組比較明顯升高。見(jiàn)表1。

表1 RNAi后MKN-45細(xì)胞凋亡率的變化

注：a為與NC組比較，P<0.05；b為與MOCK組比較，P<0.05。

2.5 對(duì)體外HUVEC細(xì)胞血管生成的影響

96孔板中鋪Matrigel，用收集的目的細(xì)胞培養(yǎng)上清液重懸HUVEC細(xì)胞，鋪96孔板。培養(yǎng)后加入Calcein AM，室溫孵育。掃板得結(jié)果見(jiàn)圖2。根據(jù)圖片及數(shù)據(jù)分析結(jié)果可見(jiàn)，與對(duì)照組比較，KD組血管生成主要相關(guān)參數(shù)中，血管面積、平均血管長(zhǎng)度、平均血管寬度、血管節(jié)點(diǎn)數(shù)無(wú)顯著性差異(P>0.05)，見(jiàn)表2～5。

表2 血管面積

注：a為與NC組比較，P=0.014；b為與KD組比較，P=0.047；c為與KD組比較，P=0.577。

圖2 血管生成情況圖片

組別平均血管長(zhǎng)度/μmMOCK組90.20±7.62abNC組73.78±13.31cKD組67.30±6.70

注：a為與NC組比較，P=0.137；b為與KD組比較，P=0.017；c為與KD組比較，P=0.493。

表4 平均血管寬度

注：a為與NC組比較，P=0.033；b為與KD組比較，P=0.283；c為與KD組比較，P=0.840。

表5 血管節(jié)點(diǎn)數(shù)

注：a為與NC組比較，P=0.095；b為與KD組比較，P=0.006；c為與KD組比較，P=0.300。

3 討論

Nodal是早期胚胎發(fā)育的關(guān)鍵信號(hào)分子[1]。同時(shí)，Nodal有助于維持人類胚胎干細(xì)胞多潛能干性[2]。阻斷或干擾Nodal信號(hào)通路將影響胚胎細(xì)胞的分化[3]。

有研究顯示，Nodal在腦膠質(zhì)瘤、惡性黑色素瘤、乳腺癌等多種惡性腫瘤中均能高水平表達(dá)，且表達(dá)水平與腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為緊密相關(guān)[4-6]。Hardy等認(rèn)為Nodal的激活控制著惡性黑色素瘤的侵襲性行為[7]。Hendrix等認(rèn)為侵襲性腫瘤細(xì)胞類似胚胎祖細(xì)胞，也表現(xiàn)出可塑性；胚胎微環(huán)境Nodal表達(dá)下調(diào)可逆轉(zhuǎn)侵襲性黑色素瘤細(xì)胞惡性表型，使腫瘤細(xì)胞可塑性喪失[8]。提示Nodal在維持腫瘤細(xì)胞惡性表型方面有重要作用。

胃癌的臨床特征和易轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的生物學(xué)特性，暗示Nodal信號(hào)同樣也有可能在胃癌的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色。

基于此設(shè)想，本研究通過(guò)RNA干擾胃癌細(xì)胞株中Nodal基因的表達(dá)，進(jìn)行相關(guān)功能學(xué)研究。以揭示Nodal與胃癌的發(fā)生發(fā)展的聯(lián)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，干擾后的胃癌細(xì)胞凋亡率明顯增加。可以推測(cè)Nodal信號(hào)是胃癌的促生長(zhǎng)因素，其表達(dá)的強(qiáng)弱與胃癌的發(fā)生發(fā)展之間存在一定的聯(lián)系。實(shí)驗(yàn)還顯示，胃癌細(xì)胞株中Nodal基因的表達(dá)強(qiáng)弱對(duì)HUVEC細(xì)胞血管生成無(wú)顯著影響。對(duì)于Nodal基因促胃癌細(xì)胞凋亡的具體分子機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。

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(編輯：吳小紅)

Effect of RNA Interference Targeting Nodal Gene on Apoptosis in Gastric Carcinoma Cell and Angiogenesis

YU Jieli,QIU Yu’an,LIU Liyan,et al.

Jiangxi Cancer Hospital,Nanchang,330029

Objective To construct and identify lentiviral vector harboring RNAi based on Nodal gene,and to investigate the role of Nodal gene in gastric carcinoma and angiogenesis.Methods siRNA sequences targeting Nodal mRNA were designed.The sequences was connected with lentiviral vector.Gene sequencing was used to identify that recombinant lentivira l vector was constructed successfully.The plasmids were transfected into 293Tcells.Indentification by fluorescent microscopy confirm lentiviral transfection and packaging successfully.The titer of the virus was also tested.The lentivirus was transfected to human MKN-45gastric adenocarcinoma cells.The expression of Nodal gene was analyzed by qPCR.Flow cytometry was used to measure the apoptosis ratio.Angiogenesis of HUVECs was assayed by Cellomicsmetry.Results DNA sequencing suggested that the RNAi sequence targeting the human Nodal gene was correct,The titer of the virus was 5.0×108TU/ml.The expression of Nodal gene was knockdown after the lentivirus transfected to MKN-45cells.Apoptosis ratio of gastric carcinoma cell significantly increased after RNAi targeting Nodal gene(P<0.05).There are no significant altering on angiogenesis(P>0.05).Conclusion The Nodal gene RNAi recombinant lentiviral expression system is constructed successfully.The recombinant lentiviruses show significant inducing effects on apoptosis in gastric carcinoma cell.

Nodal;RNA interference;Lentiviral vector;Gastric carcinoma;Angiogenesis

江西省青年科學(xué)基金資助項(xiàng)目(編號(hào)：20132BAB215018)

330029江西省腫瘤醫(yī)院

邱宇安

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.03.016

R735.2

A

1001-5930(2017)03-0401-04

2016-11-04

2016-11-22)